细胞电融合方法
- 点击： 作者： 来源：湖南农大 日期：2007-12-14 本站论坛
(2)将电融合池内两电极距离调整成1-1.5mm，并用毛细吸管吸取制备的原生质体悬液约0.1-0.2ml置融合池中，盖上盖片，注意在融合池中，特别是在两电极间不能容有气泡。
(3)净融合池置于显微镜载物台上，并将两电极的精出端与仪器的输出电缆接通，然后用低倍镜(10×10)找出融合室中央两电极间的焦面，此时可观察到原生质体呈平均分布状态，互不接触。
(4)打开输出开关，原生质体在高频交流电场作用下，迅速按电极垂直方向排列，此时应控制正弦电压大小，如果原生质体接触缓慢，可适当提高正弦电压：如果原生质体间接触过快，应立即降低电压，否则相互接触的原生质体很快会连接成串珠状。
(5)选择两个相互接触的原生质体，并转向高倍镜(1OX40)观察(图1)，将开头搬向复合输出，然后将控制开关搬向“自控”档，此时会按给定的频率发出连续脉冲，每一脉冲都伴有报鸣音响，两原生质体每接受一次脉冲刺激后，在视野中可观察到产生轻微颤动，当连续发送5-10个脉冲刺激后，约30s内可观察到两原生质体接触点处的质膜被击破穿，并开始融合(图2)，经过7至10几分钟，原生质体逐步融合(图1)，当融合的两细胞变成一个圆球形，融合过程结束(图2)，如果此时再观察电融合室中两电极间其它部位，由于原生质体大小的不同决定其表面张力及其膜特性的差异，可观察到有的已融合完毕，有的正在融合之中，即两原生质体有的呈哑铃状，有的呈长圆形或卵圆形。
动物细胞融合的融合方法及条件基本同上，但因动物细胞的膜结构(特别是红细胞膜)比原生质体具有更大的电刺激耐受性，因此要造成细胞接触点处的膜击穿，需要适当加大脉冲电压，脉冲宽度或增加刺激次数，通常在做动物细融合时，当电极距离在1-1.5mm范围，可将脉冲电压调到200-250V，脉冲宽度调至0.1ms，电刺激次数为10-15次；如果以鸡红细胞为融合材料，当施加以上电刺激参数后，可在显微镜下观察到很多的双按体细胞。
附一 影响细胞融合的因素
一，用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；二是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80％以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占10—20%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。
在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。
为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质．如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。
二、在做原生质体融合时，其原生质体游离的状况对完全细胞融合至关重要，游离出好的原生质体应具有折光性强，呈饱满的球状体，质膜与细胞质无明显界限，此种原生质体在电刺激下很易融合．当观察到原生质体不呈现球状体，且折光性差，呈暗褐色，细胞的质膜部位有一层较厚的膜状物，这与游离过程脱壁不净有关，此种原生质体在电刺激下很难产生融合，如果继续加大各项电参数刺激，则细胞被击破。
三、根据近几年国外报导，在细胞悬液中加入链霉蛋白酶E (pronase E)，可改变细胞膜结构，并增强膜活性，按每毫升l-3mg配制，能使细胞融合率增高，我们利用0.6mol/L的甘露醇液配制成每毫升含pronae E lmg做为细胞悬液，然后按每毫升含红细胞2×10
5个，在37℃下温育30min，然后按原定各项电参数进行电融合，通常以GXN液作为稀释剂，一般使用浓度都在50％左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低．我们的实验证明，如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂，配制成6％--8％的PEG（Mw=000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高．
附二 利用聚乙二醇(polycthyleneglycol，简称PEG)
为媒介物进行细胞融合
一、实验目和的原理
掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法．当前普遍认为聚乙二醇
分子能改变各类细胞的腆结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。
二、溶液配制
1、Alsver液(同前)
2、0.85％生理盐水液
3，GXN液
NaC l8g、KCl0.4g、Na2lOP04·2H201.77g、NaH2P04·H2O0.69g，葡萄糟2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml重蒸水中。
4、50％PEG液
实验前临时配制，根据需要称取定量PEG(Mw=4000)，放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，如做细胞培养融合实验，可用高压蒸汽灭菌30min，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。
三、融合方法
1、取制备的鸡红细胞(制备方法同前)悬液lml，加入4min0.85％生理盐水，混匀后以1000-1200r/min离心5min，去上清液后．再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9的生理盐水，其它条件同上。
2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入2—3mlGKN液，混匀后待用。
