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植物体内的转氨基作用

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-10 　本站论坛

目的要求
1. 掌握转氨基作用的特点，了解转氨酶的作用；
2. 学习纸层析基本技术。

原理
植物体内通过转氨酶的作用，α-氨基酸上氨基可转移到α-酮酸原来酮基的位置上，结果形成一种新的α-酮酸和一种新的α-氨基酸，所生成的氨基酸可用纸上层析法检出。

试剂和器材
一、试剂
绿豆芽子叶及胚轴，0.1mol/L丙氨酸溶液，0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液（用NaOH中和至pH7），含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH8.0），磷酸缓冲液（pH7.5），正丁醇，甲酸，0.1mol/L谷氨酸溶液，0.1%～0.25%茚三酮丙酮溶液。
二、器材
研钵，10ml量筒，离心机，试管，移液管，恒温箱，漏斗，层析缸，层析纸，毛细管，吹风机。

操作方法
一、酶液的提取
取发芽2～3天的绿豆芽5g，放入研钵中，加2ml磷酸缓冲液（pH8.0）研磨成匀浆，转入离心管。研钵再用该1ml缓冲溶液冲洗，并入离心管中，以3000r/min的转速离心10min，取上清液备用。
二、酶促反应
取3支试管编号，按下表分别加入试剂和酶液（单位ml）

将试管摇匀后置于37℃恒温箱中保温30min。取出后各加3滴30%三氯乙酸溶液终止酶反应，于沸水浴中加热10min，使蛋白质完全沉淀，冷却后离心或过滤，取上清液或滤液备用。
三、层析
取层析纸一张，在距底线2cm处用铅笔划一水平线，在线上等距离确定5个点，作为点样位置，相邻各点间距2.5cm。取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液分别点样，反应液点5～6滴，标准液点2滴。每点一次用吹风机吹干后再点下一次。最后沿垂直于基线的方向将滤纸卷成圆筒，以线缝合，注意纸边不能叠在一起或接触。
在层析缸中放入正丁醇、甲酸、水推动剂的混合试剂（15:3:2）。待缸内蒸气饱和后，将滤纸筒垂直放入，展层，待溶剂前沿上升至距滤纸前沿约2cm取出，用铅笔标出前沿位置。吹干，剪断缝线，以0.1%～0.25%茚三酮丙酮溶液喷雾，置烘箱（60℃）内或用吹风机烘干后显色。

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