| 过氧化氢酶活性的测定（氧电极法） | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-10 本站论坛 |
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过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品
氧电极仪 记录仪
电磁搅拌器 超级恒温水浴
注射器、 微量注射器 容量瓶
反应杯 亚硫酸钠
过氧化氢酶
50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0（见附表2）。
50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。
操作步骤
1．仪器的标定
按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2．绘制酶活性标准曲线
(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl（例如浓度为20、30、40、50U/ml等），记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。
3．样品测定
(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
实验作业
1．生物体内的过氧化氢酶有何生理意义？
2．过氧化氢酶与植物的其他代谢有何联系？
3．在测定时为什么只要记录最初90秒钟的放氧曲线来计算酶活性？
参考文献
1．Goldstein, D. ．D.: 1968. ．Anal.Biochem., 24:431─437.
2．Luis A. ．del Rio, et al.: 1977. ．Anal. ．Biochem., 80:409─415.
3．Rorth Mikael and P. ．K. ．Jensen:1967. ．Biochem, Biophys. ．Acta, 139:171─173.
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