植物种子中主要不饱和脂肪酸的分离（反相纸层析法）

一、原理
在纸层析中，通常支持相是含水的，移动相是有机溶剂.但是脂肪酸（fattyacid）等化合物宜用有机溶剂为支持相和以含水溶剂为移动相，这样能更好地进行分配，也就是所谓“反相纸层析法”。由于不同的脂肪酸在两相中分配系数不同，所以在层析滤纸上移动速率就有差异，这样就使混合脂肪酸各组分被分开。然后用醋酸铜处理，将脂肪酸转化为相应的铜盐，再用红氨酸显色，即可得到蓝灰色点状层析图谱。

二、材料、仪器设备及试剂
材料：油菜籽。
（二）仪器设备：1. 层析纸；2. 层析缸；3. 层析架；4. 显色盘；5. 烘箱或电吹风；6.微量进样器。
（三）.试剂。

三、实验步骤
（一）样品制备切样：将一粒干燥的油菜种子，用刀片沿着与脐平行的方向切下外子叶一部分（注意不要损伤胚），装入小指管中（或用有穴白瓷板代替），也可采用整粒种子。酯化：向盛有样品的小试管中加入0.1ml（2滴）KOH-CH₃OH溶液，并将样品用玻棒研碎，然后放置6～8h。加入0.15ml（2～3滴）1mol/L HCl及0.1ml（2滴）石油醚。
（二）点样在层析纸一边用铅笔轻轻划一直线，每隔1.5cm用铅笔轻轻点一记号，编号。将层析纸放入石腊油溶液中浸泡，取出凉干（使编号向上）。在层析纸各编号处，用针刺一小孔，然后用毛细管取样品上清液0.01ml，按编号顺滴入孔洞处（每次取样后，用石油醚洗微量进样器的针头）。
（三）展开溶剂系统与条件将点好样的层析纸固定在层析架上（使编号朝下），放入盛有醋酸溶液的层析缸中，醋酸溶液的多少以能浸泡层析纸但液面低于点样处为宜。至展层剂上升到距滤纸顶端1cm处为止，取出层析纸，凉干。
（四）显色：将层析纸浸入醋酸铜溶液中，使生成脂肪酸铜盐.用清水稍许冲洗，再放入洁净的瓷盘中，用流水漂洗0.5h左右。将层析纸小心取出，用干毛巾或滤纸吸干大部分水分后，置于40℃烘箱中干燥。将层析纸在红氨酸溶液中一带而过，与脂肪酸铜盐作用立即显出蓝灰色的斑点。

四. 结果分析
绘出反相纸层析色谱上五种不饱和脂肪酸的位置的示意图。
［附注］：油菜籽中不饱和脂肪酸在反相纸层析图谱中的顺序由下而上为：芥酸、花生烯酸、油酸、亚油酸、亚麻酸。