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动物的基因转殖

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-10-29 　本站论坛

经由遗传工程技术，透过人为方式，将外源遗传基因殖入或将特定的基因组（去氧核糖核酸，DNA）序列删除或更改的动物，均称基因转殖动物。目前将外源基因转殖至动物染色体，以产制基因转殖动物的方法有数种，包括原核显微注射法、胚干细胞载体法、精子载体法、反转录病毒感染法及体细胞核转置法等。其中以显微注射法应用最广，而体细胞核转置法最具研究发展潜力。

原核基因显微注射法

自从一九八○年代起，以原核基因显微注射法成功产制基因转殖动物以来，经过不断地研究创新，证实此一方法不但有效且具稳定性，故已被广泛应用。

使用原核基因显微注射法的优点甚多，包括外源基因在宿主动物染色体上的整合效率较高，且被转殖的基因可保有其整套的序列。由此产生的基因转殖动物，其所有的组织和细胞中，被嵌入的外源基因仍可正常地经由生殖细胞系传承给子代。

然而，应用显微注射法亦有缺点，例如需具备娴熟灵巧的显微操作经验。以猪胚为例，猪胚因含有许多不透明的脂肪物质，需经远心分离处理，并在显微镜下将胚旋转至适当角度，显露其细胞核后才能注入基因，因此其显微操作速度缓慢。更重要的是外源基因注入胚原核后，系以随机方式嵌入体基因组DNA中，是以原核显微注射法无法掌握基因嵌插情形。

具有纯熟的显微注射与胚移置技术的操作者，进行小鼠的基因显微注射，其外源基因整合成功的机率约为24～31％。

反转录病毒感染法

此法的原理乃是利用反转录病毒具有感染宿主细胞，并将其DNA嵌入细胞染色体DNA中的能力。当反转录病毒侵入细胞后，反转录病毒的单股RNA链即反转录为双股的DNA，进而嵌入DNA中成为前驱病毒，前驱病毒可以整合到宿主染色体中任意位置。

本法的主要步骤系将选殖的基因，先行嵌入一适当的反转录病毒载体，然后再将此等带有该选殖基因的反转录病毒载体，与透明带已被移除的4～8细胞阶段胚，在体外共同培养16～24小时，以便将外源基因带入胚的基因组中。

本法的最大优点乃一次可同时处理数目众多的胚，且只要实验室中具备反转录病毒操作经验者，即可轻易完成。惟其最大缺点在于常会产生镶嵌体的后代，且所产生的基因转殖仔鼠，其外源基因在生殖细胞系中被传承之比率，较利用显微注射法产制者为低。

利用反转录病毒法针对哺乳动物做基因转殖，在一九九八年即有成功的先例。利用体外经16～17小时培养的成熟牛卵母细胞，以显微注射方式将反转录病毒颗粒注入卵黄膜间隙，经感染后，再继续其体外成熟及受精培养。体外受精后的早期胚培养至囊胚期阶段，再移置于受胚牛的子宫中，结果顺利生下四头小牛。经分析证实四头小牛均为基因转殖动物，出生动物的转殖效率达100％。

胚干细胞法

胚干细胞系源自囊胚期之内细胞群细胞，经体外株化后所建立的细胞系，此类细胞具全能性分化能力或多分化潜能。当株化后的胚干细胞或内细胞群的细胞团注入早期囊胚腔后，可与宿主的内细胞群发生嵌合，并参与宿主细胞的分化，发育成胚体的各部组织。设若此等注入的胚干细胞，能成功地参与性腺分化，则可成为生殖细胞系的成员，使此等源自胚干细胞的遗传物质得以传承至其后裔。

目前已有多种外源基因转殖至胚干细胞的方法可供选择，例如化学药剂诱导法、生物媒介法及物理或机械处理法，藉此产生嵌合胚。经由此等嵌合胚所产生的嵌合体动物，经过回交配种后，可获得真正的基因转殖动物。

应用胚干细胞融合法进行基因转殖的基本前提，首需建立有效的胚干细胞系，且此等干细胞在生殖细胞系中亦需具有高传承率。目前为止，在小鼠方面已成功建立许多良好的胚干细胞系，且已用之多年；然而，源自家畜胚的干细胞，则仍未能有效建立。在应用胚干细胞进行基因定位或剔除时，可将外源基因以同源重组的方式，植入胚干细胞的基因组内，再依前述方法注入囊胚腔中；或配合先行育成具组织专一性的基因转殖动物，再将其与该指定位置基因转殖动物配种，以生产组织专一性基因转殖及剔除的动物。

精子载体法

本法于一九八九年，由意大利科学家勒维特雷诺（Marialuisa Lavitrano）开创成功。他先将小鼠精子与外源基因于体外共同培养，令该外源基因与精子相结合后，再以此等带有外源基因的精子，进行体外受精，将外源基因成功带入受精卵的基因组中。

一九九九年，斐瑞（Anthony Perry）利用小鼠卵母细胞的细胞质内单一精子注射技术，证实了外源基因可藉由精子头部作为载体，达到基因转殖的目的。最近，在鱼、小鼠、猪和牛的身上，亦陆续用精子载体法，成功产下基因转殖子代。

体细胞核转置法

早期克隆同源家畜个体的研究，偏重于以胚叶细胞当供核者的核转置技术，然而欲获得为数众多的同源个体仍有其限制。近年来，为加速畜群的遗传改进及提高家畜生产效益，胚的无性增殖及基因转殖技术渐受重视。

一九九七年，威玛特（Ian Wilmut）将成年绵羊的乳腺上皮细胞，以逐渐降低培养液中血清含量的方式，将供核细胞之细胞周期回归至G0期后，成功获得核转置羔绵羊——桃丽。因此，已分化的细胞核，亦可经由卵母细胞的孕育而调控至分化前的状态，此创举突破了家畜体细胞核转置及基因剔除技术的研究瓶颈。

体细胞核转置技术，一般除应用于克隆人类所需的特殊种源动物外，在畜产上也可用以克隆相同遗传背景的高产性能家畜。若进一步配合分子生物学及遗传工程技术，将可取代原核显微注射技术及胚干细胞法，生产基因转殖动物。

一九九七年许尼克（Angelika Schnieke）等人首先在体细胞核转置技术结合分子生物学及遗传工程技术方面有了突破性的发展。他先在体外进行绵羊胎儿纤维母细胞的初代培养，再将绵羊β乳球蛋白激活子与人类第九凝血因子和抗新霉素基因构筑成的融合基因，转染送入胎儿成纤维母细胞中，同时在体外培养期间以新霉素筛选，挑选出带有外源基因的细胞作为供核细胞，配合血清饥饿法调控，进行核转置动物的产制。

结果在五头出生存活的仔绵羊中，经DNA分析证实五只皆带有该外源基因，基因转殖的效率达到100％；相较于以原核显微注射法产制基因转殖羊的效率（4.35％）高出了许多。使用未经血清饥饿法调控细胞周期的胎牛成纤维母细胞当作供核细胞，配合细胞转染技术，也成功地产下基因转殖犊牛和山羊。

以供核体细胞株为载体进行家畜的基因转殖，若先在体外进行基因转殖后的细胞筛选，则能有效提升产制效率，未来将可利用此法进行基因定位及剔除的工作，有助于做最适当的基因调控。

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