| 常规病理标本的制作程序 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-04-09 本站论坛 |
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5.固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败，有的人认为，固定液的量与组织的比应是20：1，这个要求对于小组织来说是完全可以达到的，但对于大标本来说，则是一件非常困难的事情。因为对于大医院来说，每天都有几十上百例的标本，小如大头针大小，大的达几十斤的肿瘤，对于这样大的标本，按20：1的比例来做，显然是不可能的事，既要做到组织能固定好，又不使组织吹干就必须具体情况具体处理。对于大的标本，原则上是不让其暴露部分被吹干，这是因为在现实111当中，大的标本往往露出容器一大半，因此对于这种情况，应取些脱脂棉或纱布，浸湿固定液后，盖于组织表面，以免使组织被风干，影响制片效果。
6.特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。固定剂是一种化学语试剂，有液体和固体及之分，平常使用的多为液体，Pearse指出，对每个既定的组织化学方法来说，选用最合适的固定方法是极为重要的；在组织化学研究中的准备阶段，不论采用什么固定剂，都必须尽可能确切地知道它们对于各种组织成分反应基团的效用。
7.组织的第二次固定或后固定。在一般的常规病理活检组织中，往往用一种固定液，就能够达到目的，获得满意的结果。但是，对于某些特殊病例光用一种固定液是不够的，必须根据不同的情况，使用特殊的固定液再次将组织固定，或者在切片后染色前再行固定。这种方法称为二次固定或后固定。例如：胚胎性横纹肌肉瘤，由于肿瘤细胞发育较幼稚，完全不象成熟的横纹肌组织所固有的横纹，在进行特殊染色前，就必须用Zenker氏固定液进行第二次固定，方能较好地显示出横纹肌纤维来。否则，效果不佳。另外，电镜固定的标本，通常都需要后固定。其使用方法是先用戊二醛固定，再用奥酸固定。
（四）固定液的使用
当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：
Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。
Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。
Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等.
上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。
（五）甲醛
甲醛商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛气体饱和于水而成，比重为1.12。它也可以稳定的固体形式存在，它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。
甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反应。甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。
甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环。甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。甲醛有这种交联的功能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。
甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.
从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:
1.组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.
2.固定均匀,穿透力强.
3.能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.
4.能保存脂肪及脂类物质.
5.成本较低.
虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点:
1.杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.
2.含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.
3.可产生福尔马林色素,影响观察.
4.不能固定尿酸和糖类物质.
5.容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.
6..可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗(24天的冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败.
应用甲醛,可以配成许多种固定液:
1.10%缓冲福尔马林固定液
甲醛 100ml
蒸馏水 900ml
NaH2PO4·H2O 4g
Na2HPO4 (无水) 6.5g
该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固定较好,损伤较少,因对其后的各方面的研究都较好,尤其是对免疫组化的染色.
2、10%福尔马林固定液
甲醛100 ml
自来水900ml
这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。
3、10%福尔马林盐固定液
甲醛100 ml
自来水900ml
Nacl9克
先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染色，增加染色的强度。
4、Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液75 ml
甲醛2 ml
冰醋酸5 ml
该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平。
5．醛糖钙固定液
甲醛100ml
蔗糖300ml
乙酸钙20g
蒸镏水90ml
先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。
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