当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。从免疫组织化学的角度来说,甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测,据多人认为,它对lgA ,lgM,J链,K链和λ链的标记效果较好,且背景清晰。但美中不足的是:经它固定的组织,可与蛋白形成醛交联蛋白,这种醛键可封闭抗原。固此,在免疫组化实际检测中,应根据不同的要求和需要,采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法,以便破坏醛键重新暴露抗原。 (2)酒精:又称乙醇,为无色透明的液体,沸点是78度,工业酒精是95%。 酒精它有许多优点: 1.可保存尿酸结晶和糖原等物质。高浓度的酒精如95%,无水酒精可保存上述两种物质,因它们易溶于水,因此,要证明上述两种物质的存在,就不能用含水的固定液来固定组织。 2.能在任何比例的情况下与水混合,在病理技术中,酒精是一种十分重要的试剂,它起着关键的作用。如果没有酒精,将会无法完成必要的工作。如组织的脱水,切片染色前后都离不开酒精,在常规的工作中,通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。 3.可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去,才能进行染色,能除去石蜡的物质有苯及汽油等,常用的有苯类试剂,苯不溶于水,但能溶于酒精,酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用,为切片入水架起了桥梁,因此称它为桥梁试剂。 4.能除去切片上的水份,使切片无水化。切片经染色后,由于所用的试剂都为水溶液,因此在切片上含有大量的水份,这些水份经系列梯度酒精的置换吸附后,到无水酒精中已完全无水,这样处理对于切片的保存是有好处的,否则,切片将会褪色。
5.可用来保存标本。大体标本经福尔马林固定后,如为了陈列保存,必须取出冲冼。然后移入75%的酒精中。如果用福尔马林作陈列标本的固定液,则因为福尔马林含有杂质较多,液体容易酸化,时间一长,会逐渐变为微黄色或淡黄色,影响美观,影响陈列的效果。 6.可与其它试剂配成多种的混合固定液,有时为了加快固定,常采用酒精和其它试剂来配成混合固定液,这种固定液在固定的同时,兼有对组织脱水的作用。应用酒精配成的混合固定液有: ①Carnoy氏固定液 氯仿 300ml 冰醋酸 100 ml 95%酒精 600 ml 该固定液固定组织快速,在固定的同时兼有脱水的作用。溶液中的氯仿和酒精,对组织的收缩较厉害,但应用了冰醋酸,这种现象便被中和去。 ② AF固定液 甲醛 100 ml 冰醋酸 50 ml 95%酒精 850 ml 这种固定液的作用与上液有相似之处,但要注意的是,凡使用含有醋酸的固定液,其脱水用具不能使用铜制的脱水盒,因冰醋酸跟铜离子起反应,生成醋酸铜,这种物质可沉淀于组织间,可破坏组织中的抗原,造成免疫组化检测的失败。应用时应多加注意。 酒精也有许多不足之处,它的缺点是: 1.可溶解脂类物质,凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时,切不能用含有酒精的固定液去固定组织,也不能用石蜡切片,因为酒精可将它们溶解去,而石蜡切片组织中含有的脂类物质,则在组织脱水时被溶解去,只留下脂类或类脂物所占有的空间。 2.对组织收缩较大,不宜作单纯固定液。高浓度的酒精,对组织有显著的收缩作用,造成组织发硬易脆,难以切片等现象。因此,它不作为单纯的固定液。 3.渗透力不强。当用酒精固定组织时,组织表面很快就被固定,并形成了一层蛋白膜,这层膜可阻挡固定液向里渗透,造成了中间组织固定不佳的现象。 4.可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,凡经酒精固定的组织,核的染色都不好。 5.可脱去切片上已着染的各种颜色,切片经染色后,一是必须洗去多余的染液,二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时,必须仔细地掌握显微镜下观察,还要掌握酒精的浓度,低浓底的酒精脱色力强,稍不注意,便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时,要较快地通过低浓度的酒精,以免使已着染的颜色被脱去。 6.价格较贵。从经济学的角度,应用酒精固定组织划不来,例如:一瓶500ml的甲醛,可配成500ml的固定液,按每例标本需要100ml计,可固定50例标本,而一瓶 500ml的酒精,即使配成80% 酒精,也只能固定6例标本,因此,若用酒精固定组织,其价格比用甲醛固定组织的要高8倍。 (1)冰醋酸。冰醋酸为无色透明的液体,易挥发,气味大,一打开瓶盖,整个文章都可闻其味道,纯醋酸在17℃时常为结晶状,因称为冰醋酸,在冬天使用时,可用微波炉进行解冻,再行使用,它的优点有: 1.能迅速固定染色质,助于染色,用醋酸配成的固定液,其作用快,固定效果均匀,对于染色质的固定快,因此,用其作固定的切片染色好,在配其它染色液如明矾苏木素和伊红时,常常需加入一定量的醋酸,以促进染色。 2.能使组织尤其是富含纤维的组织膨胀。 各种固定液对组织都有收缩的作用,尤其是对富含纤维的组织。而它不但不会使组织收缩,而且还会令许多组织发生膨胀的作用。根据这个特点,用它配成许多种不同的混合固定液,以达到固定好,收缩少,易切片,效果好等目的。用它配成的混合固定液有: (1)Zenker氏固定液:[6] 重铬酸钾 25G 升汞 50G 蒸馏水 1000ml 冰醋酸 50ml 先将重铬酸钾和升汞溶于水中,尢其是重铬酸钾,应用热水或加温的方法将其溶解,然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中,如暴露于空气中,该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深,导致失效。临用时,取贮存液950ml,加入50ml的冰醋酸,即可使用。 应用该固定液固定的组织,一般不要超过24h,取出组织,流水冲冼12小时以上,然后保存于75%-80%的酒精中,在切片染色前,必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组织,细胞核及细胞浆染色十分清晰,特别是要显示骨骼肌的横纹时,应用本液可获得满意的结果,但由于其含有醋酸,故不能用于保存细胞颗粒,红细胞及含铁血黄素。
(2)Flemming氏液 2%酸水溶液 200ml 1%铬酸水溶液 700ml 冰醋酸 100ml 该液中的奥酸对脂肪组织既有固定作用,又有染色作用,对有髓神经纤维也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色,该液不适合。应用该液固定的组织,切片不能太大过厚,一般1-2毫米厚固定时间1-3天,后经水洗,保存于80%酒精中,除上述两液体外,还有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有许多不足之处:
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