(七)裱片
将漂浮于水面上的已展开没有皱折的切片捞于载玻片上的过程称为裱片或捞片。现在市售的烘烤箱都与裱片器连在一起,裱片器上的水温在界定温度后,它可自动调节。裱片时水温很为关键,一般在45-55℃,如果水温过高,超过石蜡的熔点,切片将会被熔化掉,如果水温过低,在30度以下,切片则裱不好,皱皱巴巴,不能完成展片任务。
切片放入水后,在合适的水温中它会自然展开,有个别没有展开的,用小镊子慢慢将其展开,镊子的用力要恰到好处,如果用力过大,切片会被搅破,如果用力不对,切片无法展开。应特别注意。当切片展开后,用载玻片(有人喜欢用蛋白甘油涂于载片上,但据我们二十几年对二十几万张活检切片的经验,没有蛋白甘油涂片也能行)插入水中,靠近展开的切片捞于载玻片上,捞片时应尽量保持裱片器中的水不晃动。一张载玻片可以捞一张切片,也可以捞数张乃至十几张,这要看组织的大小和病理的需要,一般说大的组织捞一张切片就已足够,小的组织最好就要求多捞一些。
(八)烘烤切片
切片的烘烤看似简单,只在烘烤箱或干燥箱一放,让其烘烤就行了,但从某种意义上讲,它也是一个关键,如果切片烘烤不好,到染色的时候,便会使切片脱离载玻片(掉片),使整个过程毁于一旦,因此,认真烤好切片是制好切片的前提。怎样才能使切片烘烤得好呢?我们的做法如下:当切片裱于载玻片后,于烘烤箱边竖立起来,控干水份,然后平放于烘烤箱的烤板上烘烤,温度可调至70℃。当最后一个蜡块切完后,前面的切片也烤得差不多了。
关于切片的烘烤,尤其是需做免疫组化切片的烘烤,要特别的注意对抗原的保存,使它们能在合适的烘烤切片时间内既不受到破坏,又能尽量地显示出现,经多组多次的实验认为,温度和时间是极为重要的。温度过高能使蛋白变性,抗原失活至丧失,时间过长,也会致使其失活和丧失。最初有人主张切片在60℃以下烘烤30-60min,然后进行染色,依此法进行实验,结果切片脱片率高,切片松动的占100%,由于切片附贴不牢,染色时不敢用PBS充分冲洗,造成背影染色加深,鉴别特别困难。又由于脱片严重,重染次数增多,延误了诊断,也造成人力物力的浪费。究竟什么样的温度及时间才能做到既使切片附贴牢固,又不会对抗原造成影响的呢?经实验证明:切片在60℃恒温箱中连续烘烤3-5小时最为合适。这种时间和温度烘烤出来的切片,可以用于抗原修复,PBS的冲洗,可满足做免疫组化的一切需要。切片在上述的烘烤时间和温度是否对抗原有影响呢?笔者认为,不必为此而担心。因为活检组织块浸蜡时,浸蜡箱的温度都调在65℃左右,组织块在这样的温度中起码要浸泡2小时以上,才能达到浸蜡较为彻底的要求。组织中的抗原,经过65℃的考验,保留下来的,基本上都已具有耐热性,因此,几小时的烘烤,不会对抗原有影响,实验证明,上述的理论完全正确。
(九)切片的普通染色
普通染色又称常规染色或HE(Haematoxylin and eosin)染色。它是病理技术中最常用的一种方法,通过它可以做出病理诊断和发现寻求别的辅助方法,以达到准确,完整的病理诊断。
(1)染色目的
病理学的所有切片,都必须通过一种以上的染料,通过各种不同的方法,将切片中各种不同的物质,在不同染液的作用下,将其显示出来,使之在光学显微镜下,能够完全的观看各种结构。例如,HE染色,好质量的切片可以清晰地显示出许多不同的结构,细胞核着蓝黑色,细胞浆着粉红色,软骨着蓝色等。清晰的结构为诊断提供可靠的依据,因此,染色技术也是病理技术中的重要组成部分,必须不断地总结,方能提高。如果染色不好,切片染色一团糟,红蓝不分,结构不清,层次不明,影响了镜下的观察,直接影响了临床诊断,染色结果的好坏直接关系到诊断的准确性。
(2)染色的作用
1.化学作用:所有的染色液中,可把它们分为两种类型,一种为酸性,另一种为碱性。酸性染料中有染色作用的为阴离子;碱性染料中有染色作用的为阳离子,每个细胞也存在着两种物质,细胞核含的是酸性物质,细胞浆含的是碱性物质。在染色时,细胞核中的酸性物质与苏木素染液中的阳离子发生作用,细胞浆中的碱性物质与伊红染液中的阴离子发生作用,由于反应的部位不同,结果着色有异。
2.物理作用:在染色过程中,染液中的色素微粒子浸入到被染组织的粒子间隙内,此时,因受分子的引力作用,色素微粒子被吸附而着色。由于各种组织有不同的吸附能力和不同的吸附程度,因此就可显出来不同的颜色来。
一般来说,染色的学说还有许多,但说服力强的仅有上述两种。但不管怎么样解释,实际上完成的每一种染色,都与上述两种学说分不开,它们的作用是相辅相成,同时存在的。
(3)染色方法及步骤
1.人工苏木素,伊红染色法(HE法)
⑴切片浸入二甲苯中5-10min;
⑵切片浸入二甲苯中5-10min;
⑶100%酒精1min。
⑷100%酒精1min。
⑸95%酒精1min。
⑹95%酒精1min。
⑺90%酒精1min。
⑻80%酒精1min。
⑼自来水洗1min。
⑽浸入苏木素染液浸染10-15min。
⑾自来水洗30second-1min。
⑿1%盐酸酒精分化30second。
⒀流水冲洗15min以上。
⒁1%伊红酒精染3-5min。
⒂90%或95%酒精分化30sec。
⒃95%酒精30sec-1min。
⒄95%酒精30sec-1min。
⒅95%酒精30sec-1min。
⒆100%酒精1min。
⒇100%酒精1-2min。
(21)碳酸二甲苯1min。
(22)二甲苯1-2min。
(23)二甲苯1-2min
(24)二甲苯1-2min。
中性树胶封固。
结果:细胞核被染成深蓝黑色;细胞浆被染成粉红色;软骨及钙盐被染成蓝色;胶原纤维染成淡粉红色,嗜酸性细胞及嗜酸性颗粒呈鲜红色;弹力纤维呈淡粉红色;某些蛋白性物呈粉红色等。
结果:
染色时的注意事项:
①切片用二甲苯脱腊,应视不同的季节有不同的脱蜡时间,在夏天,室温较高,脱蜡较迅速,往往在2-3min就可脱蜡干净,二在冬季,时间应相对延长。
②切片在进入二甲苯前,可用电吹风吹切片,使切片上的蜡处于熔解状态,这样脱蜡较迅速,尤其是冬天,此法更可行。
③切片上的蜡一定要清除彻底干净,否则将影响染色,造成切片染色不均的现象。
④切片进行无水化处理,这一步骤,一是可增加切片的附帖,二是可延长苏木素的使用寿命。切片用二甲苯脱蜡后,不能直接水洗,因二甲苯不溶于水,必须经过酒精,酒精可溶解二甲苯,又能与水混合,按照以前教科书的要求,切片在整个染色过程中,都不要让其干燥。经过多年的实践及经验,笔者认为,切片用酒精将二甲苯彻底消除后,在进入苏木素染液前,可用电吹风吹干,这一步对于切片没有充分的烤片时间,对于血块等的切片来说,尤为重要,切片经此步骤,增加了附贴的牢固性,减少切片在染色过程中脱离载片的机会,保证了染色的成功率。另者,切片进入苏木素染液全无水,可保证了苏木素染液的浓度和PH值,延长其使用寿命。以往切片进入苏木素染液前,都须经水洗,每次染色,都带入不少的水分,稀释了苏木素染液的浓度,改变了它的PH值,使染液寿命缩短。
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