[目的与原理]
掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。
采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。
[实验对象]
鲤、鲫或草鱼。
[试剂与器材]
显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.85—0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。
[实验步骤]
1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。
2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。
鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。
图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区
尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。
将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。
3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。
4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。
计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。
5．计算
红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。
计算公式为：红细胞数/mm3 = 5个中格红细胞数×稀释
倍数/计数的5个中格容积
（1）稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。
（2）计数室5 个中格容积为0.2×0.2×0.1×5 = 0.02 mm3。
白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。
计算公式为：白细胞数/ mm3 = 4个大方格白细胞数×稀释倍数/ 计数的4 个大格容积
（1）稀释倍数等于稀释液0.38ml 血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。
（2）计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4= 0.4 mm3
[方法评估]
采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种自动化分析方法，但该方法由于经典、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。
[应用意义]
红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的1/2，故使血液呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100—300万个/mm 3，高者可达400万个/mm3 低者数万/ mm3。
鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。
鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。
[注意事项]
1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→ 95%酒精（两次）→ 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。
2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。
3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。
血细胞稀释液
1、白细胞稀释液
冰醋酸（破坏红细胞） 1.5毫升
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