| [实验目的]
通过测定动物血清(或血浆)中甲状腺素(T4)含量，初步掌握放射免疫法(Radio-Immuno-Assay,RIA)的测定原理和方法。
[实验原理]
被测抗原(Ag，如血中T4)与放射性同位素标记的抗原(※Ag,如125I-T4)对它们的特异性抗体(Ab；T4抗血清)具有竟争性结合能力(13.5-1)。
当特异性抗体(Ab)的量一定,且少于标记抗原(※Ag)与未标记抗原(Ag)之和时，未标记抗原(Ag)的量愈大，标记抗原(※Ag) 与抗体结合生成的结合物(※Ag -Ab)的量就愈少。在这样条件下标记抗原(※Ag) 与抗体（Ab）的结合百分率可用下式(13.5-2)表示：
这样※Ag -Ab的量同Ag的量之间就存在着一定的函数关系。以已知标准的未标记抗原(T4)的不同浓度为横坐标,以其相应结合百分率做纵坐标，绘制标准(剂量反应)曲线。
该实验以被检动物血清（血浆）样品的T4和125I-T4对一定量的T4抗血清中的抗体产生竞争性结合，使用沉淀剂将其抗原-抗体结合物沉淀，测定沉淀物的放射强度（cpm）。计算被检样品的抗原-抗体结合率，可在标准曲线上查到相应的T4的含量。
[实验对象]
各种动物
[实验药品]
被检动物血清(或血浆)，检测T4药盒, 巴比妥缓冲液
试剂配制：
(1)0.075 mo1·L-1 pH 8.6的巴比妥缓冲液 称15.6 g巴比妥钠溶于900 m1蒸馏水中，用6 mol·L-1 HCl pH到8.6，加0.1 g叠氮钠，0.5 g牛血清蛋白，最后加蒸馏水至1000 m1。
(2)标准T4工作液 将不同量分装的标准冻干品5瓶，准确地用缓冲溶液(各瓶加0.5m1)稀释成为20、40、80、l60、320 ng·ml-1系列标准T4工作液，放4 ℃冰箱内备用。
(3)125I-T4应用液 将125I -T4冻干品用缓冲液稀释成约10000 cpm·100-1 ·u1-1。
(4) T4抗血清应用液 将T4抗血清(即抗体)冻干品按药盒要求的滴度稀释，放4℃冰箱备用。
(5) 免疫沉淀剂 用分子量6000的聚乙二醇(PEG)60 g溶解于缓冲溶液中，使体积为200 m1即30％ PEG溶液，放4 ℃冰箱备用。
[仪器与器械]
γ-计数仪、微量加样器及塑料吸头(50 ?l，100 ?l，1000 ?l)、测定管、试管架、防水记号笔、恒温水浴锅、试管振荡器、蠕动泵、离心机、冰箱。
[实验方法和步骤]
1.制备被检样品： 取血待凝固后，分离血清或取抗凝血液经3000r· min-1离心10 min，分离血浆。
2.将测定管编号，零标准空白管（Bo）和空白管（N）各为三管，T4不同浓度标准管（20、40、80、160、320 ng·ml-1）和样品管（S）均为双管平行。
3.各管按操作程序表(表13.5-1)加入各项试剂，加入抗血清后，振荡混匀，置于37℃水浴中保温一小时。
4.保温后取出，待冷继续加试剂PEG溶液，加完后充分振荡、混匀、离心(3000 r·min-1)20 min。
5.在已离心的测定管中任抽三管置于γ-计数仪先测定其放射性强度（cpm），求其平均值即代表每管的总放射性强度(总T)。
6.将各管上清液用蠕动泵抽去(包括已测定的三管)，然后全部置于γ-计数仪测定每管沉淀物(B)的放射性强度cpm。
[注意事项] 准校准。加不同试剂、样品必须更换吸头，避免误差。
3.测定管应用聚苯乙烯或聚氯乙烯试管，而玻璃试管常因管壁厚薄不一致，影响γ计数。
4.试剂尽量加到试管下部，靠近液面，但吸头不要与液面接触。加样后必须振荡，混匀。
5.抽吸上清液时，必须小心吸尽，但切勿吸走沉淀物，以免影响结果。
6.注意防护，在操作过程中，切勿使125I标记物液体外溢， 避免放射性污染桌面或地面。测定后将污染的试管放在指定器具内。
[实验结果]
1.按公式(13.5-3)及(13.5-4) 分别计算标准管结合百分率和样品管结合率。
(13.5-4) 式中B(S):已知浓度(或样品)的未标记抗原和标记抗原进行竞争性结合后,标记的抗原和抗体的结合率；
Bo (So): 标记(或样品)抗原和抗体在没有未标记抗原存在的情况下的结合率(可以是同一值)。
试剂空白管（N）cpm: 只有标记抗原，而无抗体的非特异性结合的放射强度。
2.以已知标准抗原(T4)的不同浓度为横坐标,以其相应结合百分率做纵坐标，绘制标准.
(剂量反应)曲线（图13.5-1）。
3、以样品的相应结合百分率(S／So)，从标准曲线中查出T4值。
※4、结合百分率亦可用B／T×100﹪表示：其中B为标准管，(或样品管)的cpm，T为总放射性强度平均值(包括※Ag -Ab和游离※Ag放射强度之和:即上述步骤5所说)。纵座标用B／T的结合百分率表示。
※5、也可将标准曲线经过Logit转换而成为直线，然后用回归方程计算出激素的含量。
(1)先将标准曲线直线化；
(2)用直线回归公式求b和a值
归公式求b和a值
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