蛙类离体心脏灌流

【摘要】
心肌具有自动节律性收缩的特性，可以用人工灌流的方法研究心脏活动的规律及特点；还可以观察灌流液成分的改变对离体心脏活动的影响。制备离体蛙心，插管进行人工灌流，改变灌流液的成分，记录心脏波动曲线，可以分析不同灌流液对于蛙心脏活动的影响。
【关键词】 灌流
【Abstract】
Cardiac muscle has auto-rhythmicity. We can use the perfusion to study its regulation and features and analyze the effect of different. By changing the ingredients of the perfusion liquid and recording the heart fluctuating curve, we can analyze the different effects of different perfusion liquid.
【Key Words】Perfusion
【前言】
对离体的蛙类心脏进行灌流，学习斯氏离体蛙心灌流法。观察Na 、Ca2 、肾上腺素(Adr)、乙酰胆碱(ACh)等对离体心脏活动的影响，分析心肌的生理特性。
【动物与器材】
蟾蜍或蛙、常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、0．65％NaCl、5％NaCI、2％CaCl2、1％KCl、1：5 000肾上腺素、1：10 000乙酰肌碱、300U／mL肝素。
【方法、步骤与实验结果】
1．仪器准备
打开计算机采集系统，接通张力传感器输入通道。从显示器的“设置”菜单，弹出“设计实验标记”对话框，选择“蛙心灌流”后，再从“实验项目”的“循环实验”中，选定“蛙心灌流”实验(用以标记实验)。所用仪器若无此设置，可以用通用标记作实验标记。
2．离体蛙心的制备
采用斯氏蛙心插管法。
取一只蛙或蟾蜍，双毁髓后背位置于蜡盘中，按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎(动物个体小时，结扎位置可靠上些)。再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量(套管内2～3 cm高度)任氏液(内加入一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管，山开口处插入动脉圆锥(图见下页)。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内(于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管，并使液面随心脏搏动而亡下移动，表明操作成功(否则需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管※用双结扎紧(不得漏液)，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致(1.5～2 cm)，即可进行实验。
3．将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。
4．实验观察
(1)记录正常心搏曲线

(2)改用0．65％NaCI溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线 氏插管装置出现明显变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2—3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致(以下同)。

观察可得，NaCI溶液会阻遏心脏搏动。
(3)向套管内加2～6滴5％NaCI(较细的套管需少加)溶液，作好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化。当曲线出现明显变化时，应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标※记，迅速用新鲜任氏液清洗2～3次，待心搏恢复正常。

(4)同法向套管内加入1～3滴2％CaCI：溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常(如果恢复迟缓，可多次冲洗)。

(5)向套管中加1—2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更换灌流液，待心搏恢复正常。

观察可得，KCl溶液会阻遏心脏的搏动。


(6)同法记录套管中加入l～2滴的肾上腺素溶液(1：5 000)后心搏曲线的变化。


观察可得，肾上腺素溶液会加剧心脏的搏动。

(7)同法记录套管中加入1—2滴乙酰胆碱溶液(1：10 000)后心搏曲线的变化。
观察可得，乙酰胆碱溶液会阻遏心脏的搏动。

5．整理记录，并将测量的心搏曲线数据填入表。

实验项目		心率/次min-1	振幅/mm	基线变化	其他
0.65% NaCl	对照	50	23	无	灌流后幅度大幅下降 心博曲线不稳定 恢复后振幅变大
	给药	50	6
	恢复	52	27
5%NaCl	对照	52	30	无	灌流后福大下降一半左右 更换溶液后恢复较快
	给药	50	14
	恢复	50	28
2蔆l2	对照	47	40		加入CaCl2后振幅变大，然后振幅逐渐减小基线上升，达到最小值之后基线渐渐回落，接近初始时振幅逐渐增大
	给药	46	25	上升
	恢复	46	36	回复
1%KCl	对照	46	34	无	加入KCl后振幅急剧下降 更换溶液后缓慢恢复
	给药	干扰严重无法测得	5
	恢复	44	42
Adr	对照	24	28	无	加入Adr后幅度增大 更换溶液后幅度较给药前略有增大
	给药	26	41
	恢复	26	37
Ach	对照	25	35	无	加入Ach后振幅急剧下降 更换溶液后缓慢恢复
	给药	25	5
	恢复	27	31

【讨论】
1．心肌动作电位的产生和传导是以Na 、Ca² 和K 三种离子的活动为基础的。下面将动作电位的形成机制简述如下
首先，在0期时，电压门控式Na 通道开放和少量Na 内流，造成肌膜部分去极化，膜电位绝对值下降；而当膜电位由静息水平（膜内－90mV）去极化到阈电位水平（膜内－70mV）时，膜上Na 通道开放概率明显增加，出现再生性Na 内流，于是Na 顺其浓度梯度和电位梯度由膜外快速进入膜内，进一步使膜去极化，膜内电位向正电性转化。当膜除极到一定程度时，Na 通道就开始失活而关闭，最后终止Na 的继续内流。
复极1期时快钠通道已经失活，同时激活一种一过性外向电流（I to），从而使膜迅速复极到平台期电位水平。K