黄体生成素的放射受体测定

[实验目的]
以放射受体分析法（Radio-Receptor-Assay,RRA）测定动物血浆LH含量为例，学习和掌握放射受体分析法基本原理及方法。
[实验原理]
放射受体分析法(RRA)是竞争性放射分析法之一。放射性标记激素和受体发生可逆的结合而形成复合物，此时，如果体系中加入未标记激素，就会同标记激素竞争受体上的结合位点。当放射性标记激素、受体的含量恒定时，随着未标记量增多，放射性标记激素一受体结合率将递减。这样就可以绘出激素受体结合率-剂量标准曲线。根据被测样品激素-受体结合百分率,在标准曲线上可查到被测样品中该激素的含量（见实验13.5）。
由于绒毛膜促性腺激素(hCG)能与大鼠卵巢黄体细胞上的LH受体结合，而许多动物的黄体生成素(LH)又能与hCG对大鼠卵巢黄体细胞上的LH受体产生竞争性结合。当以不同浓度的放射配体（※hCG）和定量的LH受体制品孵育达到平衡时，用一有效快速方法使※hCG-LH受体分离出来，可测定※hCG-LH受体结合放射量，即为相应浓度下的总结合量。当大剂量的非放射hCG与LH受体一起孵育时，以占据LH受体的识别位点，不让※hCG与LH受体结合，在该情况下测得的结合量称为非特异性结合量。总结合量与非特异性结合量之差即是相应浓度下的特异结合量。根据实验13.5原理可计算不同浓度的标准hCG与LH受体的结合百分率。同样也能计算出不同样品中LH与LH受体的结合百分率，从而推算出样品中的LH浓度。
[实验对象]
25~30日龄雌大白鼠。
[实验药品]
被检动物血清(血浆)， 125I-hCG，缓冲液，生理盐水，牛血清白蛋白(BSA)，hCG，孕马血清促性腺激素(LCG，PMSG)。
试剂配制：
1.0.04 mol·L^-1 pH7.4 Tris-HCl缓冲液（含1％BSA）。
(1)取三羟甲基氨基甲烷2.438 g加重蒸馏水至100 ml，即为0.2 mol·L^-1 Tris液。
(2)取0.2 mol·L^-1 Tris液25 ml加0.1 mol· L^-1 HCl 42 m1，即配成0.2 mol·L^-1 Tris-HCl(pH7.4)。
(3)用5倍重蒸馏水稀释0.2 mol·L^-1 Tris-HCl液，并调整pH到7.4即成0.04 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液，再加BSA(使含1％)。
2. 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)pH 7.4
NaH₂PO₄(H₂O) 34.5g Na₂HPO₄ 35.5g
NaCl 4.5g BSA 2.5g
重蒸水 加至1000 mI
[仪器与器材]
注射器(2ml)，外科剪，外科镊，玻璃匀浆器(10 ml)，尼龙网，可调微量加样器及吸头(50 ?l，100 ?l，1000 ?l)，酸度计，离心机，恒温水浴，试管振荡器，水泵，γ-计数仪。
[实验方法和步骤]
1.受体的制备
(1)选用25~30日龄雌性大白鼠5只，每只皮下注射PMSG 50 IU，48 h后再注射hCG 25 IU，6~10天(卵巢受体含量最高)用颈椎脱臼法处死，摘取黄体化的卵巢(卵巢增大，可见卵巢上陈旧的排卵点)。
(2)大鼠卵巢匀浆制备：将黄体化的卵巢置于4 ℃Tris-HCl缓冲液中剥离脂肪、去膜和血管后称重，每100 mg卵巢(湿重)加10 m1缓冲液，在玻璃匀浆器勾浆6次左右(每次以20 r·min-1 匀浆约1 min，关键看是否已匀浆出物质)，然后用双层尼龙网过滤，除去残余结缔组织，滤液以800 r·min-1离心10 min弃去沉淀物，留上清液再用2000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，沉淀按每ml缓冲液含100 mg卵巢组织的浓度制成悬浊液，分装成小瓶于-20 ℃保存备用。
(3)受体稀释曲线（以选择最适受体浓度）： 分别取卵巢组织匀浆0.2，0.5，1，2，3，4，6，8 mg加125I-hCG 100?l，加磷酸缓冲液，最终反应容积500 ?l，测定结合率，应选获得较大结合率的最小受体量（如2 mg ）作为测定中的受体用量。

2.RRA操作过程(见表13.6-1)：
(1)设标准曲线各管浓度为0.15，0.32，0.63，1.25，2.5，5 ng·m1-1(用磷酸缓冲液稀释)各取50 ?l，双管平行；
(2)血清或血浆样品取量为50 ?l，双管平行；
(3)各管加Tris-HCl缓冲液100 ?l；
(4)各管加受体匀浆200 ?l (含卵巢组织2 mg)，振荡混匀在37 ℃水浴中保温30 min，然后在冰浴中停留5 min终止反应。
(5)各管加入125I-hCG l00 ?l (约10000 cpm)，振荡混匀，继续在37℃水浴中保温2.5 h(进行竞争结合反应)。
(6)保温完毕后，各管加缓冲液200 ?1，在冰浴中停留10 min终止反应以3000 r·min-1离心20 min。
(7)任取三管置于γ-计数仪，先测定总放射性(cmp)求平均值，即代表每管的总放射强度(总T)。用水泵吸弃各管上清液，将沉淀物置于γ-计数仪测定每管沉淀物的放射性强度(cpm，即为B)。
在测定总T和各管B时，应将实际测得的放射性强度减去非特异结合管的放射性强度（N）才是它们实际的特异性结合的放射性强度。

[注意事项]
1.取大鼠卵巢制备受体过程匀在低温(4℃)条件下进行，以免影响结合率。
2.制备的组织悬浊液(含受体)分装小瓶，保存在-20或-30℃可供较长时期使用。切勿多次解冻。
3.被测样品的加入量是根据血中LH水平和测定经验选定的，如果样品中含量较低或较高，在做标准曲线时，可先用不同量的样品预测，从而选择适当的加入量。
4.高度纯化的激素标准品是建立RRA法的先决条件，这一点与RIA类似。但RRA法中的激素标准品，不但可以用重量单位，也可以用生物活性单位。
[实验结果]
1.以标准的HCG的浓度为横坐标，相应的HCG-LH受体结合率（B/T%）为纵坐标，绘制竞争结合标准曲线。
2.以样品的相应结合百分率(S／So)，从标准曲线中查出T4值。或参考实验13.5-7公式计算出样品中LH含量（单位为ng·ml-1）。