三、试剂
1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。
四、操作步骤：
1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。
8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
基因组DNA的检测
上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。
1. DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。
3. 取2μg DNA, 用10单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。
如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。
（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。
（3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。
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