聚酶链式聚合反应（PCR）发明以后才开始的（Mullis，Fallona 1987）。
经过一定时期的物理、化学作用（几十年至几百万年）的DNA 往往存在比较严重的降解，DNA 片段常常仅有几百个bp 的长度，并且可能存在碱基的修饰和一些抑制PCR 反应的物质。因此，在从陈旧或古老样品中提取DNA 时，最为关键的问题就是防止现代DNA 的污染。进行DNA 提取操作的所有器皿、器械和试剂均要进行灭菌处理，提取过程应在超净台中进行。此外，提取时应设阴性对照，以监测是否存在外源DNA 的污染。下面介绍的是一种较为简便的提取方法。
（1）取样品少许（如哺乳动物的皮张可取 1cm × 1cm 见方的小块），用剪刀、手术刀等器械对样品表面进行处理，除去最容易遭受外来污染的表层。对于骨骼、琥珀等坚硬的样品则需要用小钢钻等特殊器械从内部取得样品。
（2）经过表面处理的样品用90％乙醇、70％乙醇和去离子水依次进行清洗。
（3）在灭菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去离子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 体积的（20μl）10％的β-巯琉基乙醇。处理过的样品放入上述溶液前要尽可能剪碎。
（4）在56℃下消化48 小时。
（5）样品管中加入等体积的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋涡混合器上振荡5～10秒钟，然后在98℃下放置20～60 分钟。
（6）振荡混合5～10 秒钟，并使之冷却至室温。
（7）12 000r／min 离心 5～10 分钟。
（8）小心取出上层清液，置另一干净的管中保存。
7．3 植物总DNA 的提取
1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）分离（Murray，Thompson 1980）和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离（Sung，Slightom 1981）等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植
物标本和化石中分离出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷冻保存。如果没有条件，最好在无水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取应尽快进行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。
提取DNA 的过程中有许多因素能导致DNA 降解。首先是物理因素。因为DNA 分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA 分子发生断裂。因此，在实际操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源DNA 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致DNA 降解。所以在提取DNA 的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液，以适应不同的植物材料。分离缓冲液的pH 值有时需要进行改进，pH 应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最适点在 5．0～6．0 之间，而DNA 酶pH 值最适点在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在过酸的条件下，DNA 脱嘌呤会导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多植物DNA 提取缓冲液的pH 值为8．0，有的甚至为9．0。缓冲液中包含了大量的复合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸钠）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸盐（DEPC）、溴化乙锭（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物质有些是抑制内切酶和非特异性核酸酶的，所以在其后的步骤中要将其除去。分离DNA 与蛋白质一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿对蛋白质均有极强的变性作用，而对DNA 无影响。下面的方法描述DNA 与污染物多糖的分离，也可用阴离子交换层析仪来进行。下面列出了3 种常见的分离植物总DNA 的方法。3 种方法溶解细胞膜和分离蛋白质的方法不同，各有其优、缺点。
7．3．1 CTAB 缓冲液方法
这是最广泛地用来分离植物DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂CTAB 溶解植物细胞膜，并与DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本（木乃伊、化石）到许多克的新鲜材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。
7．3．l．1 CTAB 的实验方法
1．材料
（1）2 倍CTAB 缓冲液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0
1．4mol／dm３NaCI
20 mmol／dm３EDTA
2％ CTAB（W／V）
1％ PVP-360（W／V）
0．2％ß-巯基乙醇（体积比，用前在通风橱中加）
（2）清洗缓冲液：
76％乙醇
10 mmol／dm３乙酸铵
（3）悬浮缓冲液：
10 mmol／dm３乙酸铵
0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8．
2．步骤
（1）加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。
（2）在热研钵中放人0．5～1．5g 新鲜或冰冻的叶子，用7．5ml 2 倍CTAB 分离缓冲液研磨（可加些石英砂帮助研磨）。对冻干的组织用1 倍CTAB 缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 缓冲液冲洗研钵，将冲洗液加到管中。
（3）将试管在60℃下放置30～60 分钟，然后轻轻振荡，使之充分混合后降至室温。
（4）在试管中加入10ml 氯仿－异戊醇（24:1）萃取液（如颜色深可再进行一次），轻轻摇晃使其混合，在室温下1500r／min 离心5 分钟，使其分相。
（5）将上层的水相倒入－15ml 管中，加2／3 体积的冷异丙醇，轻轻混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分钟或更长时间。
（6）室温下 800r／min 离心 3～5 分钟，如果看不到小团或沉淀，可在－20℃下放置 20分钟再离心。
（7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，这时的核酸一般松散地贴在管的底部，加 15ml清洗缓冲液，轻轻地旋转清洗沉淀物，15～20 分钟后核酸将变得更白。
（8）室温下800r／min 离心5 分钟（如不充分，则加大离心速度或延长离心时间），倒掉清洗缓冲液，将管倒扣在纸巾上，让沉淀物干燥，小心不要让DNA 滑掉。
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