一 酶切和电泳

在200 μl 微量离心管中加入：

25 μl DNA样品(约10μg)，

3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）

5 μl 相应的10×buffer，

补水到50μl。

然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agrose胶，加入上样buffer后，在25—30V稳压电泳12—16hrs。

注意：在southern杂交中对，DNA的质量要求较高，否则酶切不完全导致失败。

二 转膜

1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液，偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。

注意：此方法对酶切后目标片段大于15kb时用，如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理，否则容易将片段打断，导致转膜后结合不紧密。

2 取一磁盘架上一洗净玻璃板，在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液，在玻璃板上架两层长滤纸（30cm左右）（注意不要产生气泡）搭成盐桥。（滤纸比胶弱宽）依胶大小裁好尼龙膜，写好标记，正面向下，紧贴于胶上，防止有气泡产生，接这压两张同样大小的滤纸，不可过大以免短路，胶周围用X光片压条。胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。堆积吸水纸。上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。

注意：防止短路

3 转膜16---20hrs后，将尼龙膜取下，胶染色，观察转膜效果。将膜用2xSSC浸泡20分钟，滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs（80℃）。待用。

三 杂交

杂交炉与杂交管预热至65℃

尼龙膜用2×SSC浸泡

配置杂交液

ssDNA沸水变性10min，冰浴10min，置冰浴备用

Components Volume (ml) Note

ddH₂O 20.7

50×Denhardts 0.6

P/H stock 8.1

20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6)

Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.

Add prepared ssDNA （10mg/L） ≥0.3 ml

倒入杂交液，加入尼龙膜，65℃预杂交4~5小时（新膜）

注意：赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入杂交液，盖好管盖。

四 探针标记

（for1~2 blots）

ddH₂O 7 ml

Marker 1.5 ml

模板DNA 2 ml (about 100 ng)

沸水变性8min，冰浴10min，瞬时离心

Add Buffer Primer 7.5 ml

Add dNTPs(-dCTP) 3 ml

Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)

瞬时离心

Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)

37℃ 水浴≥4小时

五 杂交

向标记探针的离心管中

Add 等体积TE 25 ml

Add 10×体积变性剂（杂交液） 250 ml

沸水变性10min，冰浴10min，将变性好的探针加入到杂交液中，混匀，65℃杂交过夜（12~16小时）。

六 洗膜

1. 2×SSC,0.5%SDS 5min

2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)

3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)

(洗膜过程中不断检测放射性强度直至200~500)

滤纸吸干洗液，保鲜膜包好，暗室中压片，根据放射性强度暴光若干天。

冲洗X光片。

说明：

由于做southern的整个过程比较复杂涉及到的试剂也比较多，我这里仅做了个简要的叙述，但基本的实验过程已列举出来了，此过程中的试剂可以根据具体的实验要求适当调整，如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具体的介绍，请与我联系，我们共同讨论学习，另外，做杂交的过程中一定要注意防止同位素泄漏，做好个人的防护工作。