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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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推荐：PCR扩增产物的检测分析

点击： 作者： 来源： 时间： 1970-01-01 　本站论坛

PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。
1．琼脂糖凝胶电泳
这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。
（1）制胶
琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。
（2）加样和电泳
上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。
（3）检测
将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：
①分辨率很强，可达1bp；
②能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA；
③回收的DNA纯度高；
④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍；
⑤避免了EB迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：

(1)制胶
在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：

试剂

3.5%

5%

8%

12%

20%

30%丙烯酰胺溶液（ml）

11.6

16.6

26.6

40

66.6

水（ml）

67.7

62.7

26.6

40

66.6

5×TBE（ml）

20

20

20

20

20

10%过硫酸铵（ml）

0.7

0.7

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