（二）克隆载体的选择
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA
载体的选择标准：
•能自主复制；
•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
•分子量小，以容纳较大的外源DNA。
（三）外源基因与载体的连接
1、粘性末端连接：
•同一限制酶切割位点连接
•配伍末端连接
2、平端连接
适用于：限制性内切酶切割产生的平端
粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接
由末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
（四）重组DNA导入受体菌：
受体菌条件: 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态
导入方式：转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（五）重组体的筛选
1、直接选择：
抗药性标记选择
插入失活法
标志补救
分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
原位杂交
2、非直接选择法：免疫学方法：如免疫化学方法
酶免检测法
•重组DNA技术简单概括为： “分、切、接、转、筛”
重组DNA技术与医学的关系
（一）疾病基因的发现与克隆
（二）生物制药
（三）基因诊断
（四）基因治疗
（五）遗传病的预防
小 结
自然界基因转移伴发重组的形式有多种。
细菌的基因转移包括接合、转化、转导作用等，在这些过程中不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。
• 重组DNA（基因克隆）技术是应用酶学的方法, 在体外将目的基因与载体DNA接合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子，经扩增提取获得大量同一DNA分子。
• 重组DNA技术的基本过程可概括为“分、切、接、转、筛”。
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