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基因治疗（Gene therapy）

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-06 　本站论坛

要成功地进行基因治疗的因素：
1。针对所治疗的疾病选择恰当的治疗基因。
2。基因运送系统：可以将治疗基因准确地送达需要治疗的细胞或组织，并有效地发挥作用。
3。和基因表达调节系统：包括控制治疗基因表达的时间、区间和水平。
一、治疗基因定向运送系统
基因定向运送的关键是选择合适的基因运送系统和提高靶细胞对它们的识别和相互作用。已经发展了许多方法使治疗基因能够定向地运送到希望它们到达的组织或者细胞。
1．对基因运送系统：病毒载体、非病毒载体、分子结合载体等
1．1病毒载体：病毒载体是使用最多的治疗基因载体。在目前，72%临床试验计划和71%病例使用病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。
目前已被用作载体的病毒有：
1）逆转录病毒
2）腺病毒
3）腺相关病毒载体
4）痘苗病毒
5）单纯疱疹病毒。
1．1．1逆转录病毒载体：通过基因工程改造，使病毒载体成为只有一次感染能力的重组RV载体。
逆转录病毒用作载体时需进行的改造：
（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因。
（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能。
（3）将载体DNA导入辅助细胞以产生有感染力的病毒载体。
（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达。

反转录病毒载体的优点：
①是具有穿透细胞的能力，可使近100％的受体细胞被感染，转化细胞效率高；
②它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；
③随机整合的病毒可长期存留，且单拷贝、单位点，很少发生重排；一般无害于细胞；
④可包装10KB外源基因。
反转录病毒载体缺点：
①这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。
②最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。
③操作较复杂。
操作过程：目的基因有缺陷的逆转录病毒→重组DNA装入质粒→导入辅助细胞→分泌有感染力的病毒颗粒→感染宿主细胞→培养2~3天→筛选
1．1．2腺病毒载体（ADV）：腺病毒（AD）为较大的双链线状DNA，基因组约36kb。AD通过受体介导的内吞作用进入细胞内，其外壳在细胞内降解，然后其基因组移位至细胞核。在细胞核中AD并不整合于细胞染色体，而是以染色体外的成分存在。目前所用的AD载体已将其基因组E1和E3区删除，删除区可容纳7kb的外源基因。
最近，美国设计了一个新的腺病毒载体，它是用一个化学连接器即赖氨酸链（lysine chain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体（adeno- virus –polylysine DNA-complex）。
优点：
①比较安全：用其制备的疫苗，在美国已使用20年，实践证明是安全、无致瘤、致癌、致畸。
②宿主广泛：能感染处于不同分裂周期的细胞，包括不再进行分裂的神经细胞。
③治疗操作简单AD可在呼吸道及肠道繁殖，因而治疗方法有静脉注射、口服、喷雾和气管内滴注等。
④可插入外源基因容量大，7~30KB。
⑤易制备、纯化，目前对其基因结构、功能了解得较清楚。
通过对其细胞向性的绝对专一性进行精细改进，结果使得复制型病毒载体有可能用于基因治疗。在治疗肿瘤时，研制携带细胞因子基因或者自杀基因的复制型腺病毒载体，在细胞结合水平上，或者在基因转录水平，将它们靶向肿瘤细胞，就可以使肿瘤病灶中部分恶变细胞被病毒转导。由于腺病毒介导的细胞裂解所造成的细胞死亡甚至比细胞因子造成的效果更大，又由于ADV载体被局限在肿瘤细胞范围内，所以，这个系统是很安全的。
缺点：
①重组DNA以游离的附加体形式存在于细胞中，不整合于细胞染色体，表达时间短。
②反复使用可诱导机体免疫反应。
③几乎可以感染任何细胞，而缺乏特异性。
1．1．3慢病毒载体：近年，以人免疫缺陷病毒（HIV）为基础建立的慢病毒基因载体日益受到重视。它们的优点是可以整合入分裂后的细胞，因而特别适合于神经系统疾病；没有免疫原性，可以多次使用转基因可以长期表达。但是，它们也有一些缺点，主要是：外源基因的容量小；病毒的滴度低和细胞靶向性差。因此，还需要对它们进行改造以适于实际应用。
1．1．4其他：利用病毒本身侵染的专一性，比如RV专门感染处于分裂时期的细胞，ADV可以感染非分裂细胞，单纯疱疹病毒（HSV）感染神经细胞，乙型肝炎病毒（HBV）感染肝细胞，乳头瘤病毒感染乳腺细胞等等，也可以在一定程度上实现治疗基因的定向运送。
1．2脂质体载体：
在整体水平使用脂质体时：
1．避免RES（细胞内质网系统（RES）有选择地吸纳）：如，修饰脂质体的膜以减少它对RES的亲和性。
2．细胞向性：可以在它表面展示某些有向性的配基分子；携带免疫球蛋白、偶联转铁蛋白、结合病毒粒子。
1．3分子结合载体：将DNA与已证明有细胞或者组织亲和性的配体偶联就可以构成有靶向性的质粒DNA。这种偶联通过多聚阳离子，如聚赖氨酸来实现，它可以与配体共价连接。在这类脂质体中用过的配体还有：胰岛素、表皮生长因子、凝集素和转铁蛋白。主要缺点是它们的内化依赖于受体介导的胞饮作用，使得转导效率很低。

二、目前已经使用的提高基因运送方向性的方法：
A．利用表皮生长因子受体靶向肺癌细胞
B．利用叶酸受体靶向肿瘤细胞
C．c-kit受体靶向造血细胞和肿瘤细胞
D．利用核糖核苷酸还原酶靶向肿瘤细胞

三、基因治疗的应用与展望：
1、遗传性疾病：
如ADA缺乏引起的严重联合免疫缺陷症（SCID）、镰刀状贫血、血友病、地中海贫血、帕金森氏症、苯丙酮尿症等。
1）复合免疫缺陷综合征的基因治疗：
1991年美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征（SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入患儿。大约1－2月治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。

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