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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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重组质粒的构建设计

点击： 作者：51protocol收集 来源： 时间： 2007-03-08 　本站论坛

基因工程又称遗传工程、DNA 重组技术、分子克隆等。它是七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓基因工程，就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA 分子引入受体细胞，使外源DNA 在受体细胞中进行复制和表达。按人们的意愿定向创造生物新性状，使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，即能为工农业生产和工医药保健等开拓新途径，又能为生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供有效的实验手段。
近十余年来，基因工程的发展和应用，迅速地推动了生物科学的发展，目前，基因工程技术已成为生物学领域许多实验室的常用技术，它的先进性和普及性使人们感到有必要在大学的教学课程中得到反映。所以，我系已为十几届本科生、研究生开设了基因工程技术实验，选择一些最基本，最常用的技术，以使同学对基因工程有一个基本的了解，并能掌握一些基本技术。
但是基因工程的实际技术和实验系统正在不断的创新，新方法、新技术不断推出，而且在有限的学时内，所能触及的技术只是基因工程中极少的一部分，但从教学角度来看，是不可能面面俱到。我们只是希望通过本实验，让同学通过基因工程中最基本的技术训练，为今后独立工作打下基础。
本实验设计主要参考书为T·Maniatis 的《Molecuiar clong》第三版，彭秀玲等编著的《基因工程实验技术》等。实验中所选择的方法和条件以适合于本实验室设备为首选，具体参考应用时，可作适当更改。
本套实验设计过程如下：
1. 染色体DNA的抽提
2. PCR 扩增分离目的DNA 片段
3. 载体貭粒的抽提、纯化及检测
4. 载体及目的DNA 片段的限制性核酸内切酶酶切与连接
5. 重组貭粒转化大肠杆菌
6．重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定

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·DNA的克隆
·重组DNA的转化和蓝白筛选
·体外重组
·大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化
·DNA的酶切实验
·重组质粒的抽提、鉴定与凝胶成像技术
·重组DNA分子的转化
·功能基因cDNA3'末端的克隆
·碱性磷酸单酯酶基因的定位、克隆与表达
·功能基因cDNA 5’末端的克隆
·DNA重组实验
·基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列
·感受态细胞的制备实验技术
·重组质粒的筛选
·生物安全和重组DNA技术
·外源DNA片段在质粒载体中的克隆
·感受态细胞的制备[电转化法]
·构建无需限制性内切酶和连接酶的cDNA文库
·电穿孔技术在动物克隆及转基因中的应用

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