基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列

一．原理
基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子) 或下游序列的方法。 其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA，然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端, 这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库；根据接头和目的基因的序列设计两组引物，以上述的DNA为模板，先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR ( touchdownPCR ) 扩增，然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增，扩增产物即为所需的DNA片段。在接头中，由于2条链中较短的一链的3’末端被 2NH2 封闭，使得引物 AP1 在第一次 PCR 之
前没有结合位点，在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸，没有 AP1 的延伸产物。而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点，在第二循环就开始从两端进行延伸反应。这样，就减少了非特异性扩增，从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。在 TD-PCR 的初始循环中，所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高，在这种情况下引物退火的效率会下降，但是特异性将增加；另外，在极少数情况下接头的 2NH2 也会延伸，补平接头，这样也产生了 AP1 的结合位点，从而增加了非特异性扩增，但在高温下，接头的自我退火比引物与接头退火的效率高，就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应，减少非特
异性扩增。在随后的循环中，退火和延伸温度比 Tm 值略低，有利于特异性产物的指数增长。基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆，该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site, STS) 或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb，但可通过多次反应获得更长的片段。该方法对于填补基因组
中的一些间隙，特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有

一、高质量基因组DNA 的提取
1 材料
实验鱼， 尾静脉取血100 μl(含抗凝剂)
2 试剂
QIAGEN Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖
3. 方法
1）样品的处理和裂解
(1) 将100μl鱼血用PBS稀释至1ml
(2) 加入1倍体积冰冷的Buffer C1，3倍体积（3ml）的ddH₂O 。
(3) 翻转数次至悬冷液成半透明
(4) 冰浴10min。
(5) 4℃，1300g离心15min，弃上清液。
(6) 加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH2O。
(7) 轻弹，溶解沉淀。
(8) 4℃，1300g离心15min，弃上清液（如沉淀不是白色，重复洗涤步骤）。
(9) 加入1ml Buffer G2，最大速漩涡10-30s，充分重悬核酸沉淀物（时间要控制得很严格）。
(10) 加入25ul QIAGEN Protease，50℃保育30-60min（如有必要可延长保育时间）。
2）DNA的提取