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重组片段的转化及克隆和筛选

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-05-05 　本站论坛

一、目的与原理
转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞，使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。
二、材料和方法
1.材料：大肠杆菌
2.仪器：
离心机，恒温摇床，恒温水浴，超净工作台，冰柜
3.试剂
LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;
TFB：10mM MES（pH 6.3）,45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作步骤
1. 感受态细胞融化（在手心）
2. 加入溶于TE的待转化外源DNA，冰浴30min。
3. 42℃热冲击2 min。
4. 冰上2min。
5. 加入0.4 ml LB液体培养基，37℃保温摇床45 min
6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上，37℃培养。
四、实验结果及分析：
培养皿上有白色菌落和兰色菌落，但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色，所以白色菌落说明转化成功；兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接，若是在原酶切位点的连接进行的转化，菌落为白色；若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化，菌落为兰色（说明在酶切上成功，连接上也成功，转化上也成功）。
五、注意事项
关键要严格控制热激时间，超过2min，则转化会失败。

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