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提高平端连接效率的方法

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-21 　本站论坛

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好，平端连接需要过夜反应。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
足够多的载体和插入片段是最重要的。要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。插入的DNA的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键。载体通常50ng就够了，若载体在10k左右，可用50－100ng。
3、平端的连接对于离子浓度很敏感，回收的时候多洗洗，加PEG和扩大酶量，22度2小时后4C过夜。
4、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过10微升，在5、6微升左右最佳。
5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好

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