| DNA的转化 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-21 本站论坛 |
|  | 实验原理：
体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。
质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转化效率可达１０５－１０７转化子/μg DNA。获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。pUC18的LacZ基因区域当有DNA插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。
DNA分子转化分以下几步:
1、 吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面；
2、 转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；
3、 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；
4、 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。
实验试剂：
LB培养基
质粒DNA（含Amp抗生基因），受体菌
CaCl2 0.1M
Amp
实验过程：
1、 感受态细胞制备及CaCl2处理：
1) 将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。
2) 挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。
3) 从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。
4) 培养物于冰上１０分钟。
5) 转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。
6) 弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。
7) 4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。
8) 加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。
2、 倒皿铺平板 ：
1) 按照各组转化反应的混合物，控制不同的选择性培养基(20 ml/皿) 。LB固体培养基(100 ml) Amp（60μg/ml） Tet(40μg/ml)供连接混合物转化，pUC18转化用, 共5皿 LB固体培养基 (100 ml) Amp (60μg/ml) X-gal (40μg/ml) IPTG(24μg/ml),供连接混合物转化，pUC18转化用,共5皿 。
2) 转化反应前一天，先铺好平板 。
3) 取各组反应物在平板上涂布 。
4) 培养皿倒置于37℃培养箱中过夜 。
5) 观察转化子出现的情况 。
3、 转化：
1) 将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，温和混匀，于冰上３０分钟。
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转化项目
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受体菌
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DNA
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总体积
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DNA对照组
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0
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10μl
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200μl
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受体菌对照组
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200μl
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0
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200μl
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转化组
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190μl
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10μl
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200μl
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