载体用CIAP,37度处理30分钟后,用连接酶自连,转化一个克隆没有,同时用处理过的载体与100bp的外源片段连接,转化后也一个克隆都不长.载体和目的片段的摩尔比在1:10。阳性对照长的也很好,该怎么办？参考见解：
1、 片断回收后电泳验证；如果外源片断是切胶回收，一定要在长波下操作
2、 载体与目的片段的摩尔比应该是1:1,质量比可以在1:3-10,多做几个梯度,不可能什么都不长的。
3、 插入片断要求酶切好,很多时候是酶切不完全而根本不能连接。比例是载体：目的片段＝1：2到1：3之间。很容易连上。
需要做PCR-based siRNA，其中的质粒模板不够，所以做转化扩增后再抽提质粒。做了3次转化都出不来，总结问题如下：
1.质粒是以前抽提过的，浓度很大，但没有做过电泳，直接加1ul转的
2.感受态制备好的，在冰上直接化开作的。
3.直接用分子克隆上的方法，100ul感受态+1ul 质粒 冰上30min,42度热激 90se c, 冰上 2min,加 LB 复苏150rpm 45min,涂Amp板100ul, 16h，但是只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。
请问这里有什么问题，有哪些要改进的？
参考见解：
感受态保存时间不要太长，最好3个月以内，保存负70度，时间长效率会降低的。
如果合适，可以用蓝白筛选阳性菌落，X-GAL和IPTG是40：7，兰色为阴性，白色阳性
保存正确的温度最少是-20℃,一般长期保存需要放置-70℃.就算是-70℃保存,一般经过3个月以上后,质粒会降解非常大.在做转化之前一定是先要鉴定质粒的浓度和质量的.如果有条件可以利用仪器测试浓度,简单的办法就是取一定量(根据质粒浓度决定)进行电泳,然后和marker比较,来测定浓度。
转化过程中的温度非常重要,特别是42℃这步,都精确到考虑Ep管管壁厚薄的影响.
关于只有第3次长了1各菌落，怀疑没有转好长得杂菌。”首先,16h是不够的,最少也要观察48h,因为转化了质粒的细菌不比正常细菌,受了伤长得很慢而且数量不会很多,有5~6个菌落就是非常好的现象.就算长了一个菌落可以挑出来摇摇看,也许就是需要的。
底物DNA没有被所用限制酶切断，怎么办？
参考见解：
底物DNA没有被所用限制酶切断，可以考虑以下几种情况：
1、 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。
2、 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，
3、 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。
4、 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。
5、 测定Sac?II酶是否失活，可用确定带该酶的一个底物，做个酶切验证就行。
请问感受态细胞里自身没有质粒吗？感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ有影响吗？
参考见解：
1、 感受态细胞自身有没有质粒同制备感受态之前的细胞有关，在制备感受态细胞的过程中，不会对细胞自身的质粒造成什么影响。
2、 感受态细胞里自身染色体上有转座子对导入的ＤＮＡ不会有影响，转座子也会插入到导入的质粒上，可能因为发生的频率比较低，所以不考虑。
实验需用PZero T载体,该载体需用高转化效率的感受态细胞(>=1*10^8cfu/ug DNA)进行转化反应,请问哪种感受态细胞是高转化效率的感受态细胞?
参考见解：其实ＤＨ１０Ｂ，ＤＨ５ａ，ＴＯＰ１０都可以，关键不是看用什么细胞，而是用什么方法制备感受态细胞，一般电转化都轻松可以达到５*10^９cfu/ug DNA以上．ＣaCL2处理一般都是５*10^6cfu/ug DNA-５*10^7cfu/ug 。
买回来的菌种均为感受态细胞，能否将它们象菌种一样制备感受态细胞，有没有影响？参考见解：
1、 保存这样的菌种，不如将质粒转化进去后，再保留有重组质粒的细菌，加入等量的30%甘油后，可以长期保存。如果直接将感受态细菌接种，肯定丧失了摄取外源基因的能力，但可以用来重新制备感受态细胞。如果加入甘油后保存在-70度冰箱内，可以长期使用，但想当作菌种是不行的。其实制备感受态细胞的方法很简单，除了冰，只要氯化钙,大约一个多小时就可以搞定，所以需要时，可以随时制备，也可以制备一批，加入甘油后在-70度保存。
2、 利用感受态细胞再来制作感受态，行肯定行，但转化效率不会很高，制备高效率的感受态细胞，其中关键的步骤是一定要细菌生长状态好。而人工制备的感受态细胞经过低温，高浓度离子，相当于细菌受过一次“伤”。因此用来做菌种保存不是太适合。
“感受态”以及“感受态细胞”的概念？参考见解：“感受态”是细胞处于易于接纳外源性目的基因进入细胞的一种状态。“感受态细胞”是指处于感受态的细胞。一般情况下，外源性基因很难进入到细胞内只有当细胞处于感受态时，外源性基因才能较容易的进入细胞。制作感受态细胞的方法有很多。
在加Cacl2 步骤换成了加Cacl2-Mgcl2为什么？ 这样做效果好么？ 怎么简便的观察感受态细胞的效果？
参考见解：Mg可以提高感受态效率。 其实可以试试TSS一步法：
TSS液：10% PEG，5%DMSO，20-50mmol/lMg 2+的LB，PH：6.5 ；摇菌DD600=0.3-0.4，（其实不必要侧，菌液有絮状浑浊就可以了） 离心集菌， 悬于少量TSS液中，加入质粒混匀， 置于4C冰箱中5-60min，加SOC或LB,培养1小时即可铺板。比CaCl法更简单，效果也还可以。
失败的原因只有一个：混进水去了。?混进水指的是收集细菌时残留的LB过多，要把管壁的残液尽量控净或擦净， 当然制备好的TSS中混进水去更不行。TSS液越老越好，TSS制备时LB多点少点问题不大，制备完后，静置时间越长，制备感受态效果越好，但制备后再混进水或LB，能使感受效率降低到刚制备的状态。转化时间不宜过长，TSS不光可以做感受态，还可抑制细菌生长。
用于制备感受态细胞的氯化钙可以高压灭菌吗?
参考见解：可以高压灭菌，高压时旋松些瓶盖，防止爆裂。当压好后，立即旋紧 4度保存，使用时按无菌原则。但最好不要高压灭菌 cacl2的浓度直接影响着感受态的转化效率cacl2浓度要控制在0.1mol/L 所以可以先过滤Imol/L母液用0.22um滤器过滤除菌 4度保存 使用时在超菌台 再用双蒸水稀释10倍使用。
感受态细胞是否可以转变成为正常的菌种？
参考见解：将感受态细胞用无抗生素的LB稀释10000-100000倍后，再涂布到无抗生素的LB琼脂平板上，可以保存或用于进一步制备感受态细胞。或者做转导之前的感受太细胞融化后析出1ul放到不含抗生素的LB肉汤里摇菌，然后再保存菌种。需要时再复苏，按照常规作感受态的方法作。
感受态细胞可以作为菌株来源并再制作感受态细胞吗？
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