| 质粒小量提取之碱裂解法 | | 点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-30 本站论坛 |
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rpm离心5－10min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。
2、 沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置
10min。
3、 加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。
4、 加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min 。
5、 微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。
6、 上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。{经验之谈：如果选用
宿主合适的话（如DH5a、XL1-red等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇
沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、
转化完全没有问题。仅供参考}
7、 小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。
8、 小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀, 4℃离心12000g×5min。
9、 上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。
10、 1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次,沉淀在室温下晾干。
11、 小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管
壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核
酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。
12、 加入50μlTE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。
注意事项：
提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。
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