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质粒大量提取之煮沸裂解法

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-30 　本站论坛

该法[根据Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修订而成] 可与随后的纯化步骤如氯化钯－溴化乙锭梯度平衡离心等步骤联合使用。建议该法只用于经氯霉素处理的培养物，未处理的培养裂解后过于粘稠，不利于操作。当从大肠杆菌ＨＢ101或其衍生质粒（包括ＴＧ1）中大量提取质粒时，不宜采用煮沸法。这些细菌释放大量糖类，在氯化铯－溴化乙锭梯度中与闭环ＤＮＡ形成密度大致相同的区带。这些糖类还抑制以ＤＮＡ为模反或底物的酶。
试验步骤：
1、将500ml 培养物的细菌沉淀物重悬于用冰预冷的10mlSTET【（0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl（pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH 8.0）】中。将悬液移入50ml锥瓶中。
2、加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉淀于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。
3、用一个夹子把锥瓶放在酒精灯的明火上加热，直至液体恰好开始沸腾，不停地摇晃锥瓶。
4、立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯（2L）中，将瓶放在沸水中，时间恰为40s。
5、将瓶浸入用冰预冷的水中５min，使之冷却。
6、将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管，于4℃以30 000rpm离心30min。原有的细菌物生长得越密，应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。必要时，可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块，或抽入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒ＤＮＡ时，一般不会出现这样的问题。如果细菌碎片没能形成紧密的团块，可以以35 000rpm再度离心20min，然后尽可能将上清转移到另一管内，弃去残存在管内的粘稠状液体。
7、将上清转移到另一管内，纯化质粒ＤＮＡ。　

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