碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。
1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。
2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。
3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。
4、以1ml流出液为1份进行收集。
5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。
6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。
7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。
9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。
[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。
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