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定量PCR技术简介

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-10 　本站论坛

三、  PCR产物的检测与定量
定量PCR检测靶基因核苷酸的含量最终是通过对其PCR产物的特异性检测和定量而推测算出来的，根据对PCR产物检测方式不同分为终点法（Terminal detection）和实时检测法 (real time detection).
(一)  终点检测法(Terminal detection）
终点检测法就是PCR扩增反应结束后，对其产物进行分析和定量检测的一种方法，终点法检测要特别注意“平台效应”对实验结果的影响。为了实现对PCR终产物的定量检测，必须对PCR产物进行预先标志。目前标志物有：放射性同位素和非放射性标志物。放射性同位素因放射性因素而目前很少用，后者包括螺旋结构染料（如溴化乙锭等）、地高辛、生物素以及荧光素（包括普通荧光素如Fam、TRAMA和镧系螯合物等），地高辛、生物素以及荧光素可以通过标志dNTP或引物的5’端从而掺入PCR扩增产物中，除荧光素标志产物可直接发光外，其余可与HRP或AKP标志的抗地高辛抗体或亲和素反应，加入底物后产生颜色、发光或荧光信号，从而进行检测。这些标志物进行标志的是检测时的捕获剂或是作为定量检测的指示剂；根据对PCR终产物的检测特异性不同又可分为：
1. 琼脂电泳扫描检测法：
PCR产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色然后进行扫描；预先用放射性标记的可进行放射自显影或特异性扩增琼脂片的放射性计数；预先荧光素标记核苷酸进行定量，DNA测序仪可克服琼脂电泳的序列非特异性检测问题，可用于内标和外标法检测，但是由于全自动DNA测序仪耗时及费用昂贵，目前仅限于实验室研究用。
2. 固相捕获法（solid phase capture）
固相捕获法多数是利用亲和素或抗地高辛抗体包被聚丙烯酰胺微孔板或磁性小珠，利用亲和素和生物素或地高辛和抗地高辛抗体系统对预先标记生物素或地高辛的产物进行捕获然后与特异性标记的探针进行杂交或非特异性检测。或是使生物素或地高辛化探针固相化，并与预先标记的PCR产物进行杂交，然后进行捕获信号显示，根据标记在探针或PCR产物终中的显示信号标志物的分分成不同的检测方法，如ELISA检测又称PCR-ELISA，电化学检测，电化学发光检测法，荧光检测法以及时间分辨荧光检测法，是目前终点法检测应用最方便的方法。目前有三种设计模式：
(1) 特异性捕获检测法（非探针杂交捕获）
本法是非特异性检测PCR产物的一种方法，用生物素标记引物和地高辛标记duTP或用生物素和地高辛分别标记其引物。经PCR扩增后，PCR产物中同时掺入了生物素和地高辛。用生物素包被孔捕获PCR产物，用酶（AKP）标抗地高辛和产物反应，加底物显色进行定量，此法是非序列特异性检测，显色来自所有的扩增产物。本法仅应用于非常特别的PCR扩增产物检测。
(2) 特异性探针捕获检测法
由于PCR产物中存在非特异性扩增成分存在，用特异性探针能够特异性检测其PCR产物，提高方法特异性。本法就是固相捕获、探针杂交相结合的一种特异性PCR产物检测方法，基本原理是用固相捕获分子和进行检测标记物分别位于不同核苷酸链上，通过核苷酸链相互杂交，靶两标记物结合在一起，其余方法同非特异性捕获法。根据其固相捕获的方式不同，又分为固相捕获探针法、固相扩增产物法，前者就是通过生物素和亲和素系统把特异性探针结合在固相上（即固相化探针），与预先标记的PCR产物进行杂交，然后一系列反应后进行定量检测。而后者就是生物素标记的PCR产物通过与预先包被在微孔板上亲和素反应而进行捕获，与地高辛标记探针杂交，标记抗地高辛抗体反应，加底物显色后呈色而进行定量检测。
3. HPLC检测法
本法为非特异性PCR产物检测法，PCR产物直接上2.5μm离子交换柱分离后，用紫外检测器进行检测。本法灵敏度可达fg水平，还可以用于长度不同的内标物检测，而且初始模板数和PCR产物峰面积之间具有良好的线性关系。
（二）  实时检测法
实时检测法就是在PCR扩增的每一个循环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产物变化曲线。根据PCR 变化曲线计算出未标靶基因分子数。由于实时检测，克服终点法检测过程中“平台效应”对结果的影响；实时检测仍然存在反应管之间和标本之间的扩增效率（Ev）的微小差异，导致结果的很大差异，故最好应用内标法进行较正。为了实现单管内进行实时检测的目的，就必须使探针上标记物（指示物）在杂交或游离状态存在发光强度差异，从而达到实时定量检测的目的。目前该技术主要有：
1、  Taqman荧光定时定量PCR
本法是由PE公司建立的定时定量PCR技术，本系统采用了两端标记了荧光素（5’端荧光发光基团[R]-FAM（6-羧基荧光素）和3’端荧光猝灭基团[Q]-TETRA（6-四甲基罗达明））的寡核苷酸探针，称为Taqman探针，Taqman PCR方法的原理是上述Taqman探针上两个荧光物质间可能发生能量转移现象，即应用Xnm的光（发光基团[R]的激发波长）照射[R]使其激发，发出波长X’nm的荧光，激发猝灭基团[Q]，其发出波长为Ynm的荧光，也就是发光基团[R]所发出的光能一部分被用于激发猝灭基团[Q]使其发光，当PCR反应开始后，Taqman探针与扩增链杂交，当新链延伸到Taq酶探针杂交位置时，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切酶特性沿5’-3’方向切除方向上的障碍物-探针而进一步延长，使Taqman 5’端发光基团[R]游离出来，能量转移现象终止，检测到[R]发出的荧光，其荧光强度与PCR产物量成正比。Taqman技术优点有a、不需开盖检测，PCR扩增过程中实施实时分析，不需要PCR结束后的分析步骤，减少污染。b 在常规PCR扩增过程中，用探针对产物进行检测，可获得较高的检出精度。
2. LightCycler双探针技术
LightCycler双探针技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5’端连接荧光分子；淬灭探针的3’端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分于便紧密相邻，从而发生能量传递而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可以进行PCR定量分析。该方法的特点是淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上因此影响扩增效率，此外由于需要合成两个较长的探针，因此合成成本相对较高。

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