Invitrogen RT-PCR 新工具
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Invitrogen RT-PCR 新工具

点击:   作者:   来源:  时间: 2007-03-07  本站论坛

panel A 使用GAPDH(1181)引物扩增HeLa细胞cDNA.

panel B 使用HMBS(329)引物扩增K562细胞cDNA.

使用SuperScript™ III CellsDirect™ cDNA Synthesis Kit从系列稀释的细胞中(10,000到1个细胞)直接合成cDNA。取2μl每个合成cDNA产物,在50μl反应体系中进行PCR反应。取20%的PCR反应物在1%琼脂糖凝胶上电泳分析。

针对困难RNA模板的Thermo-X™ RT
Thermo-X™ RT是目前可以利用的热稳定性最高的反转录酶,设计用来针对最困难RNA模板合成cDNA。Thermo-X™ RT克隆自一种嗜热真细菌(thermophilic eubacteria),比起当前来源于嗜温有机体(mesophilic organisms)的RT,如MMLV 或者 AMV具有更高的热稳定性。较高的RT反应温度通过帮助熔解GC含量高的RNA部分或者二级结构,能够潜在地减轻cDNA合成期间出现的终止(4-6),因而为困难RNA靶标提供更高的特异性,更高的cDNA产量和更多的全长cDNA产物。
Thermo-X™ RT在65℃的半衰期是120分钟,能够合成全长达9.5kb的cDNA(图5)。此外,Thermo-X™ RT不象其它竞争的热稳定RT要求Mn2 (一种下游PCR反应的抑制剂),它在存在Mg2 时就可以保持最佳的RT活性。在60℃到70℃可以获得出色的结果。Thermo-X™ RT在灵敏度、特异性、cDNA产量和靶标长度都超越了竞争对手(图6)。

 


 


图5-ThermoScript™和Thermo-X™ cDNA合成谱

 

使用15 U ThermoScript™或者 200 U Thermo-X™RT,在存在poly(A)-tailed RNA ladder,oligo (dT)20和γ32P dCTP时,在50℃到70℃下进行RT反应。反应产物在1.2%的碱性琼脂糖凝胶中分离,通过放射自显影观察。
图6-Thermo-X™反转录酶超越了其它竞争者

使用10ng到100ngHeLa细胞总RNA和基因特异引物RT反应,按照生产商的说明书,在60℃或者70℃进行RT反应。使用Platinum® PCR SuperMix High Fidelity和所示的引物对,以1kb/min进行35个循环的PCR反应。

附加信息来源
需要更多的有关invitrogen新RT-PCR工具,请登录www.invitrogen.com/PCR

参考文献

1.Kotewicz,M.L.et al.(1988)Nucleic Acids Research 16(1):265-277.
2.DeStefano,J.J.et al.(1994)Biochimica et Biophysica Acta 1219(2):380-388.
3.Potter,J.,Zheng,W.,and Lee J.(2003)Focus 25(1): 19-24.
4.Harrison,G.P.et al.(1998)Nucleic Acids Research 26(14):3433-3442.
5.Wu,W.et al.(1996)Journal of Virology 70(10):7132-7142.
6.Myers,T.W.&Gelfand,D.H.(1991)Biochemistry 30(31):7661-7666.

 


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