模板RNA：从人HELA 细胞中纯化的总RNA。反应中应用的模板浓度为100 ng 和10 ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，针对长模板的特殊RT－PCR 方案。
设置一步法RT－PCR 反应。
| 成分 |
50μl RT－PCR反应体积 |
反应成分的终浓度 |
| 不含RNA 酶的水 |
2.5μl |
|
dNTP 混合物
每种dNTP 浓度均为10 mM |
2.5μl |
500μM |
| hTSF正向引物 |
1.0μl |
200 nM |
| hTSF反向引物 |
1.0μl |
200 nM |
| 总HELA RNA |
3.0μl |
每个反应中中含10ng－100ng |
| MasterMix 1 |
10.0μl |
|
| |
|
|
| 不含RNA 酶的水 |
34.0μl |
|
| 含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液 |
5.0μl |
1×；2.5 mM 镁离子 |
| cMaster RT 酶 |
0.5μl |
0.15U /μl |
| cMaster PCR 酶混合物 |
0.5μl |
0.05U /μl |
| MasterMix 2 |
40.0μl |
|
循环程序参数
| 循环 |
步骤 |
温度 |
时间 |
描述 |
| 1x |
1 |
65°C |
5分钟 |
初始RNA变性 |
| 1x |
2 |
42°C |
60分钟 |
逆转录 |
| 1x |
3 |
93°C |
3分钟 |
初始变性 |
| 35x { |
4 |
94°C |
15秒 |
模版变性 |
| 5 |
59°C |
30秒 |
引物退火 |
| 6 |
68°C |
5.5分钟 |
引物退火 |
如图2 所示，应用一步法RT－PCR 方法，可以从100 ng 和10 ng 总RNA 中检测到5.3 kb 的hTSF PCR 产物。这个PCR 反应非常困难，大多数RT－PCR 试剂盒生产厂家从未发布过应用一步法方案，有效扩增类似长度模板的结果。相反，Eppendorf 试剂盒能稳定可靠地从10 ng HELA 细胞RNA 中扩增该产物。
实验3：两步法RT－PCR
两步法RT－PCR 的扩增目标：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA 片段
1.3kb 的（鼠和人）肿瘤坏死因子受体（TNFR1）mRNA 片段
5.3 kb 的人结节性脑硬化因子（hTSF）mRNA 片段
12.3 kb 的鼠动力蛋白mRNA 片段
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 试剂盒，采用产品说明书中的针对普通长度模板和较长模板的两步法RT－PCR 程序。所有的逆转录反应均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物为引物。
设置第一步RT 反应
| 成分 |
以Oligo（dT）20 为引物进行逆转录 |
反应成分的终浓度 |
| 不含RNA 酶的水 |
加至MasterMix 1 总体积为10μl |
|
dNTP 混合物
每种dNTP 浓度均为10 mM |
1.0μl |
1mM |
| Oligo（dT）20 引物（0.5μg /μl） |
1.0μl |
25ng/μl |
| 模版RNA |
|
|
| HELA (350ng/μl) |
3.0μl |
} 1μg总RNA |
| A细胞(1 μg/μl) |
1.0μl |
| L细胞(220ng/μl) |
4.5μl |
| McCoy细胞(135ng/μl) |
7.0μl |
| MasterMix 1 |
10.0μl |
|
| |
|
|
| 不含RNA 酶的水 |
5.0μl |
|
| 含镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液 |
4.0μl |
2×；5 mM 镁离子 |
| RTplusPCR 反应缓冲液 |
|
|
| cMaster RT 酶 |
1μl |
0.75U /μl |
| MasterMix 2 |
10.0μl |
|
设置第二步PCR 反应
| 成分 |
普通PCR（微管蛋白TNFR1） |
长片段（动力蛋白，hTSF） |
反应成分终浓度 |
| 不含RNA 酶的水 |
7.0μl |
6.0μl |
|
| 正向引物 |
1.0μl |
1.0μl |
0.2μM |
| 反向引物 |
1.0μl |
1.0μl |
0.2μM |
| 第一步逆转录反应产物 |
1.0μl |
2.0μl |
N / A |
| MasterMix 3 |
10.0μl |
10.0μl |
|
| |
|
|
|
| 不含RNA 酶的水 |
33.6μl |
32.0μl |
|
| 含25 mM 镁离子的RTplusPCR 反应缓冲液 |
5.0μl |
- |
1×；2.5 mM 镁离子 |
| 含25 mM 镁离子的 10×Tuning 反应缓冲液 |
－ |
5.0μl |
1×；2.5 mM 镁离子 |
dNTP 混合物/
每种dNTP 浓度均为10 mM |
1.0μl |
2.5μl |
200μM（500μM） |
| cMaster PCR 酶混合物 |
0.4μl（2U） |
0.5μl（2.5U） |
0.04－0.05 U /μl |
| MasterMix 4 |
40.0μl |
40.0μl |
|
RT反应条件
| 步骤 |
温度 |
时间 |
描述 |
| 1 |
65°C |
5分钟 |
初始模版变性 |
| 2 |
0°C |
5分钟 |
冷却变性模版 |
| 3 |
42°C |
60分钟 |
第一链cDNA合成 |
| 4 |
-20°C |
直到PCR |
引物退火/延伸 |
注：动力蛋白的逆转录孵育时间延长至90 分钟。
| 循环 |
步骤 |
温度 |
时间 |
描述 |
| 1x |
1 |
94°C |
3分钟 |
初始变性 |
| 35x { |
2 |
94°C |
15秒 |
模版变性 |
| 3 |
68°C |
40s/60s |
引物退火/延伸 |
* —— 微管蛋白
** —— TNFR1
hTSF 和动力蛋白的三步循环方案
| 循环 |
步骤 |
温度 |
时间 |
描述 |
| 1x |
1 |
93°C |
3分钟 |
初始模版变性 |
| 35x { |
2 |
93°C |
15秒 |
模版变性 |
| 3 |
56°C |
30秒 |
引物退火 |
| 4 |
68°C |
12分钟 |
引物延伸 |
不同大小目的片段所采用的延伸时间和退火温度
| 目的片段 |
微管蛋白 |
TNFR1 |
hTSF |
动力蛋白 |
| 延伸时间（PCR） |
40秒 |
1分钟 |
5.5 分钟 |
12 分钟 |
| 退火温度 |
68℃ |
68℃ |
59℃ |
56℃ |
| 退火时间 |
— |
— |
30 秒 |
30 秒 |
| 每循环增加时间 |
— |
— |
— |
20 秒 |
结果
对5 种不同表达水平的基因进行RT－PCR。为了得到最高的灵敏度，RT 和PCR 反应分开进行。如图3 所示，对于α微管蛋白和TNFR1，我们可以应用两步法RT－PCR 方法并将退火和延伸步骤合并为进行一次68℃ 孵育。如图3 所示，无论片段长度大小和拷贝数高低，所有反应都可以顺利进行。即使对于动力蛋白这种特别长（达12.3 kb）的极端稀有转录本，用cMaster RTplusPCR 系统也能够进行有效扩增，而且结果具有极佳的重复性，表明即使对于困难的RT－PCR 反应， Eppendorf 试剂盒也能获得可靠结果。
讨论
cMaster RT 系统是为了给所有的RT 和RT－PCR 应用提供最大的灵活性而设计的。该试剂盒结合了重组的同二聚体病毒逆转录酶和独特的RTplusPCR 反应缓冲液系统，可以在较宽的温度范围（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb产物大小范围内进行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具热稳定性DNA 聚合酶活性，校正功能辅助的保真性和高延伸效率。应用于一步法中，可以灵敏地检测到极少量的总RNA 并扩增出长达5.3 kb的cDNA（参见图1 和图2） 两步法方案可以从RT 反应中扩增多个目的cDNA，PCR产物的片段长度可增加至12.3 kb（参见图3） 其他的扩展应用：系统的逆转录部分即cMaster RT 可以与任何PCR系统合用或者为其他下游应用如杂交实验合成cDNA 探针。
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