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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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RT-PCR简介

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-07 　本站论坛

主要内容

RT-PCR原理

RT-PCR步骤

常见问题分析

两步法RT-PCR

一步法RT-PCR

两步法与一步法RT-PCR比较

RT-PCR主要用途
分析基因的转录水平
获取目的基因
合成cDNA探针
逆转录酶的选择
AMV：
禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。
MMLV：
Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛）
Super RNaseH- Reverse Transcriptase
MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化）
RNase H的作用
水解RNA-DNA杂合链中的RNA

RT-PCR引物的选择
随机引物：

适用于长的或具有发卡结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20µl体系50-250µg。

Oligo(dT15-18)：
适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20µl体系0.2-0.5µg。

特异性引物：
与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20µl体系1pmol。

提高RT-PCR灵敏度
1.分离高质量RNA

2.使用无RNaseH活性的逆转录酶

3.提高逆转录酶保温温度

4.减少基因组DNA污染

RT常见问题

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·Avoiding DNA Contamination in RT-PCR
·Two Step REAL TIME RT-PCR PROTOCOL
·RT-PCR引物的选择
·提高RT-PCR的灵敏度与产物长度
·Rt-PCR实验步骤
·Invitrogen RT-PCR 新工具
·差示反转录PCR[mRNA差异显示技术]
·Gene-specific RT-PCR
·mRNA差别显示技术[差示反转录PCR]
·反转录PCR （RT—PCR, Reversed Transcript
·RT-PCR (Reverse transcription PCR)
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