260，OD
280吸光值（A），计算RNA含量。
5 cDNA链合成：逆转录反应体积为40ul，包括标本RNA 2ug，六随机引物100ng，5×逆转录buffer 5 ul, 10 mM dNTP 1.25 ul, Rnasin 25 U, 逆转录酶200 U。37℃ 45 min, 95℃ 5 min, -20℃保存备用。
6 定量阳性模板的克隆：培养K562细胞，在细胞生长的指数期收获细胞，同法提取RNA并逆转录成cDNA，Primer Premier软件设计引物（正义：5’-AGA GCG ATA ACC AC CAA CG- 3’；反义： 5’- GGC GTT TCT CAC TGG TCT CA -3’）扩增含WT1靶序的150bp的片段，纯化、测序后克隆至pMD18-T载体（上海申友公司），抽提、纯化重组质粒，测OD值，根据分子量及阿佛加德罗常数(6.023×10
23分子数/mol)换算为分子拷贝数，按1011拷贝/ul浓度冻存于-20℃备用。GAPDH阳性模板由上海肿瘤研究所董强刚教授提供，以10
9拷贝/ul浓度存于-20℃备用。
7 实时定量RT-PCR检测：采用LightCycler(Roche, Mannheim, Germany)荧光定量PCR仪检测。以β胆色原脱氢酶（GAPDH）的表达作为内参。GAPDH的引物及TaqMan探针序列参见美国ABI公司（www.appliedbiosystem.com/user bulletin #2）； WT1的引物及TaqMan探针序列由Primer Premier引物设计软件设计，正义：5’-AGA ATA CAC ACG CAC GGT GTC T-3’； 反义：5’-GA GCC GAC CGT ACA AGA GTC-3’； TaqMan探针序列：5’-FAM-CTC CAG GCA CAC GTC GCA CAT CCT G-TAMARA-3’，PCR扩增产物为86bp。RT-PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 ul, 25 mM MgCl2 1.5 ul（1.5 mM）, 10 mM dNTP 0.5 ul（0.2 mM）,5 U/ul Taq酶0.5 ul（0.1 U/ul）, 10 mM引物及探针各1 ul（0.4 uM）， cDNA 2 ul(相当于100 ng RNA)，加双蒸水补足反应总体积为25 ul。反应条件为：50℃ 3 min预变性, 95℃ 5 min热启动,然后95℃ 20s变性, 60℃ 60s退火延伸, 40~50个循环，60℃延伸时采集荧光信号。将WT1已知阳性模板从10
8~10
1倍比稀释。以PCR循环数- △Rn作扩增曲线（△Rn=FAM信号/TAMRA信号-基线荧光信号），根据曲线即可确定CT(threshold cycle，循环阈值，即产生可被Camera探测到的FAM信号所需的最少循环数)。以一系列已知数量的DNA及其CT值作标准曲线，斜率控制在-3.20 ~ -3..50之间(最好是 -3.32)，相关系数（γ）＞0.998，待测样本中WT1的量即可根据其CT值从标准曲线上读出(如图1所示)。对于每一份标本均行复管检测，取其均值做为WT1表达水平。GAPDH的RT-PCR反应体系及条件同WT1，反应40个循环。
8 WT1表达计算方法 以看家基因GAPDH表达作为内参照，白血病患者及对照组GAPDH的表达水平一般在10
4~10
7拷贝/100ng RNA之间，WT1表达水平在0~10
6之间，如果GAPDH的表达水平低于10
4，则本份标本视为RNA质量不合格予以剔除。阳性对照WT1表达为10
5拷贝/100ng RNA，以同一份标本（WT1拷贝数/GAPDH拷贝数）×10
4 来计算WT1表达水平，定义为WT1N （normalized WT1 expression level）。
WT1质粒由10
8~10
1倍比稀释标准曲线图。显示了CT值与起始循环靶分子数的对数成线性相关，可以用来计算待测样本中WT1的表达水平。曲线斜率为-3.33，相关系数为-1.00。
图1 WT1基因扩增循环数与靶分子数关系标准曲线图
9 统计学处理 采用spss统计软件，计量资料呈非正态分布，用中位数（Median）描述，采用非参数分析各组间差异，非参数相关分析WT1与相关变量间关系，以P＜0.05 为显著统计学差异。
结果
1 急性白血病患者不同病程阶段WT1N 表达水平的变化
108例急性白血病患者中因RNA质量而剔除4例，余104例中初诊占70例，复发组11例，完全缓解组（CR组）占23例，对照组23例，经GAPDH校正后，其WT1N中位表达水平分别为75.10，89.56 ，2.07和 1.51，非参数统计分析(Mann-Whitney检验)，结果表明初诊组与复发组分别与CR组及对照组之间WT1N表达水平有非常显著差异 (P＜0.01)，而对照组与CR组之间及初诊与复发组之间无统计学差异(P＞0.05)，即初诊急性白血病患者WT1N表达水平明显高于CR组及对照组，复发时同样高于CR组及对照组。
2 急性白血病亚型之间WT1N 表达水平的比较
70例初诊急性白血病患者中AML 63例，ALL 7例，两组间WT1N的中位表达水平（分别为70.61，119.04）无明显差异；AML不同亚型中M
1 18例，M
2 23 例，M
3 9例， M
4 6例， M
5 7例，AML中以M
3亚型WT1N 中位表达最高(135.63)，但M
1、M
2、M
3各组间WT1N中位表达水平(M
1为69.03，M
2为93.62)无明显统计学差异； M
5 亚型WT1N中位表达水平最低（23.45），且与ALL、M
1、M
2、M
3各组间存在统计学差异，M
1～M
3亚型WT1N 中位表达水平明显高于M
4、M
5亚型。
3 WT1N 表达水平与染色体核型预后相关分析。
70例初诊急性白血病详细记录了染色体核型，以t(8;21)、t(15;17)、inv(16)定为预后良好型，t(9;22)、t(8;14)、伴有11q23异位及其它复杂核型定为预后较差型，分正常核型组31例、预后良好型16例及预后差型23例，非参数分析结果表明预后较差组WT1N 表达水平（155.57）与正常核型组(37.79)及预后良好组(63.81)之间有显著性差异(P＜0.05, P＜0.01)，而正常核型组与预后良好组之间无统计学差异(P＞0.05)；相关分析发现WT1N 与染色体核型预后因素呈正相关（γ=0.479, p=0.000）。
1 WT1表达水平动态变化
104例急性白血病患者中有26例随访了详细临床资料并同时进行了MDR1定性RT-PCR检测（阴性，弱阳性，强阳性），非参数相关分析结果表明WT1N 表达水平与白血病初诊时外周血WBC计数及骨髓中原始细胞比例及mdr 1表达无明显相关性。
图2 例3(AML-M
2)患者诊断时WT1
N水平动态检测结果
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