(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
（1）配制凝胶：(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1） 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
（2）预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。
（3）加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。
（3） 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
三、注意事项
1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。
2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。
3、 同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。
4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。
可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞
说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了
如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了
第二次的引物设计要求可以低一点
以50μl体系为例
引物各1μl
第一次PCR产物5μl
二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量
我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.
luoyu10 wrote:
各位大哥：
我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？
最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。
问：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？
好的引物所具有的令人满意的特点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
【经验】如何确认RNA的质量
各位都知道，提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同）是非常困难，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢？或许各位非常关心呢，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题，所以希望大家自己多多思考啊！
以下两种方法，相信大家都知道的：
1）检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2）RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的（见下图）。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
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