• ProtoScript™ 第一链cDNA合成试剂盒protocol

• 点击：    作者：   来源： 日期：2007-03-30    本站论坛

　　·采用野生型M-MuLV反转录酶
　　·随酶提供10×反应缓冲液

　　概述: 本试剂盒用莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）高效合成mRNA的cDNA拷贝。在基因特异性引物存在条件下，此单链cDNA产物可直接用来进行PCR扩增，或进行其它下游操作（图1)。
　　本试剂盒已经优化使进行逆转录反应的模板总RNA范围可以在10 pg - 2 μg之间。cDNA合成后进行PCR扩增既可检测到长cDNA（>13 kb）片段,也可检测到低丰度cDNAs样品。
　　本试剂盒提供了由总RNA或mRNA合成cDNA第一链所需要的全部试剂，并提供两种cDNA合成引物：oligo-dT(dT23VN)和随机九聚物引物（dN9），前者经过特别设计可以防止在polyA内部引发链合成。试剂盒中还含有RNase H，可在cDNA合成后除去RNA模板，当进行cDNA合成的模板RNA量少时这一步处理可提高PCR扩增的产量。另外，随试剂盒附送对照总RNA和PCR扩增用阳性对照引物。
注：V=A, G或C; N=A, G, C或T。
试剂盒组成:
　　·M-MuLV反转录酶
　　·RNase H
　　·dNTP混合物，dT23VN引物，随机九聚物引物(dN)9
　　·胎盘RNase抑制剂
　　·对照总RNA（鼠肝）
　　·对照引物（扩增GAPDH片段）
　　·10×RT反应缓冲液，无核酸酶污染的水
　　·详细的使用说明

　　图1：用不同的引物合成第一链cDNA示意图

　　使用方法:
　　1.在无菌管中加入以下样品:
　　总RNA 1-10 μl (1 ng-2 μg)
　　dT23VN引物 2 μl
　　dNTP混合物 4 μl
　　加无核酸酶污染水至 16 μl

　　2.70°C加热5分钟，短暂离心后置于冰上。

　　3.混合以下样品：
　　步骤1的RNA/引物/dNTP 16 μl
　　10×RT反应缓冲液 2 μl
　　RNase抑制剂 1 μl
　　M-MuLV反转录酶 1 μl
　　总体积 20 μl

　　4.42°C温育1小时。
　　5.95°C 5分钟使酶失活。
　　如果需要用RNase H处理，进行步骤6。否 则，进行步骤7。
　　6. 加RNase H 1 μl (2 units)，37°C作用20分钟降解RNA。然后95°C 5分钟使酶失活。
　　7. 用无核酸酶污染水将反应体系稀释到50μl，取2-5 μl进行PCR扩增反应。
　　阳性对照反应结果见图2:
　　采用上述标准反应步骤，以1 μl(0.5 μg)对照总RNA为模板合成cDNA，然后从50 μl反应产物中取5 μl进行PCR, 用对照引物扩增GAPDH片段，PCR循环程序如下：
　　94°C 2 min
　　94°C 30 sec
　　55°C 30 sec 25个循环
　　72°C 30 sec
　　产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见350 bp大小的清晰条带（图2）。

　　图2：由不同量对照总RNA起始,PCR扩增GAPDH cDNA片段结果。采用不同的总对照RNA量（从10 pg到2 μg）合成cDNA第一链，然后取1/10体积的cDNA产物进行PCR扩增。50 μl体系，25个循环。每条带上样量15 μl，最后一个样品孔为不加反转录酶的对照反应。分子量标准为250 ng的100 bp DNA Ladder(NEB #N3231)。