四、逆转录
一般使用的是2步法。逆转录反应和聚合酶链式反应。使用试剂及耗材：
AMV或使用MMLV，我们实验一般使用的是AMV，MMLV用于扩增长片段，AMV扩增长度一般小于2000bp。AMV价格在300元左右（200U），一次使用5U；
RT-buffer 10× 购买时AMV配送；
RNAase Inhibitor:50U/50ul体系 使用的浓度为10U/ul 1000U价格在120左右；
Oligo dT18 公司合成 合成价格（1.5元/bp 生工）；
dNTP 10mM 配置后的浓度为200μM。价格一般为80元/ml
以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的cDNA的量来决定：
Oligo dT-----------------------3 ul
Total RNA--------------------7 ul
RT-buffer----------------------5 ul
dNTP--------------------------2 ul
RNAase-I---------------------5 ul
3dH2O---------------------27.5 ul
AMV------------------------0.5 ul
total 50 ul
取一支PCR管，加入7ul的Total RNA（根据RNA浓度决定）和3ul的Oligo dT，在水浴锅中70℃10分钟使之充分变性。然后取出PCR管并放入冰块中10分钟，骤冷退火。使Oligo dT与mRNA配对结合。然后加入3dH2O、RNAase-I-、dNTP、RT-buffer，最后加入AMV。42℃延伸40分钟（如果mRNA有复杂的二级结构，延伸中途可以将PCR管重新放到70℃水浴）。最后94℃灭活AMV。即得到所有mRNA的cDNA。mRNA只占总RNA的1-5%。
五、聚合酶链式反应
以下是配置50ul反应体系，配置体系的大小根据后续实验需要的目的DNA的量来决定。反应体系不能简单乘以倍数。
引物稀释：n摩尔数×200=稀释体积（µl）
cDNA----------------------------2µl
dNTP-----------------------------1µl
10×PCR-buffer---------------5µl
上引-----------------------------1µl
下引-----------------------------1µl
Taq--------------------0.5µl(2.5U)
3dH2O------------------------39.5µl
Total 50µl
Taq一般60元/500单位 10×PCR-buffer和 6×loading buffer均有配送。
注：所有塑料耗材高压灭菌，55℃干燥。实验中勤换枪头，最好吸一次换一次。避免试剂的交叉污染。注意移液枪是否吸有试剂，吹打是否完全。否则以为加了试剂，其实没有加到足量的试剂，影响反应体系。
建议：实验中先加3dH2O，即方便加试剂又容易是试剂混合，最后加Taq。如果增加特异性性可以使用巢式PCR或Touch down PCR；如果需要测mRNA需要使用3’race(rapid amplification of cDNA ends)和 5’ race。
六、电泳鉴定
电泳试剂及步骤详见研究进展之六
