在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物？参考见解：
1、 RNA被降解：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理；在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT；
2、 RNA中包含逆转录抑制剂：过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复；逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐；将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂；
3、 多糖同RNA共沉淀：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖；
4、 用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火：确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列；
5、 起始RNA量不够：增加RNA量；对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA；
6、 RNA模板二级结构太多：将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火；提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP；对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用M-MLV；如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物；
7、 引物或模板对残余的RNA模板敏感：在PCR前用RNaseH处理。
8、 靶序列在分析的组织中不表达：尝试其他靶序列或组织。
9、 PCR没有起作用：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物；
10、 PCR引物设计较差：避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
11、 富含GC的模板：于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
12、 镁离子浓度太低：从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
13、 退火温度太高：使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带？
参考见解：
1、 引物和模板非特异性退火：在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
2、 GSP设计较差：遵循用于扩增引物设计的同样原则。
3、 RNA中沾染了基因组DNA：使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4、 形成引物二聚体：设计在3'端没有互补序列的引物。
5、 引物和模板非特异性退火：以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间；在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR；避免在引物3'端含有2到3个dG或dC；
6、 镁离子浓度太高 ：对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
7、 因为扩增复杂模板导致引物错误起始：使用巢式PCR或递减PCR。
8、 沾染外源DNA：使用抗气雾剂的吸头和UDG。
9、 因为二级结构导致引物结合位点无法接近：对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。
定量RT-PCR无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照？
参考见解：
1、 无cDNA合成。
2、 cDNA合成温度太高：降低保温温度。
3、 反转录cDNA产物被二级结构封闭：提高保温温度。重新设计引物。
4、 RNA被损害或降解：必要的话更换RNA。
5、 RNAse污染：维持无菌条件；加入RNase抑制剂。
6、 荧光探针无功能：确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。
灵敏度低，须在比预期更高的循环中检出产物?
参考见解：
1、 初始模板RNA不充分：增加模板RNA的浓度；使用10ng-1?g的总RNA。
2、 RNA被损害和降解：必要的话更换RNA。
3、 RNAse污染：维持无菌条件；加入RNase抑制剂。
4、 无效的cDNA：通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂。
5、 无效的PCR扩增：注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺。调整cDNA合成温度或引物设计。
信号高于预期，在低于预期的循环中即可检出产物？
参考见解：
1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。
2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
是否RNA不用反转录，而直接PCR克隆出新基因？
参考见解：PCR的底物是DNA，一定要反转录才行的。可以将rt和pcr连续进行，主要是在同一个反映管加入taq和rt酶,逆转录完成后用高温(94c)将rt酶灭活,然后再进行pcr.但是直接进行pcr是不可以的，其实rt酶也有一定的dna聚合活性,只是比较低而已。
做大鼠PEDF的rt－PCR，Pubmed 上genebank中关于此物质的核酸序列太多，请问应怎样选择？有何选择原则？
参考建议：建议将它们翻译成蛋白后进行比对，寻找保守序列，由此设计引物。或者查阅一下文献，看看该蛋白的保守domain，设计引物。其实登陆到genebank中的该基因序列应该是一致的，你找几个比较一下可以发现。但其前后还有些其它序列（如调控序列），每个人登陆上去的那些序列可能不尽一致，你可以不管。不过不是所有genebank中的基因序列都百分之百的正确！
一般情况下序列号是NM、AC或BC的比较可信，其中NM的可信度最好，据说该种序列是经过校正的。
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