1. 据我国禽流感流行情况，结合国内该病毒的遗传演化规律，在HA基因全片段范围内设计多对引物，通过分析、比较现地流行毒株的覆盖情况，确定适合于我国禽流感流行毒株的RT-PCR引物，建立H5、H7、H9、N1、N2亚型RT-PCR方法；针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的N1、N2亚型神经氨酸酶基因建立一种RT-PCR鉴别方法，建立N1、N2神经氨酸酶亚型鉴别RT-PCR方法；进一步扩展建立了以M基因为参照的A型流感病毒RT-PCR方法；并且在国内首次应用Multi-RT-PCR技术检测H5亚型禽流感病毒。在对RT-PCR工作体系进行了大量实验室研究工作的基础上，根据目前现地流行的禽流感病毒以H5亚型为主，组装了H5亚型和A型流感通用的两种禽流感RT-PCR检测试剂盒，在全国推广应用，效果良好，该方法敏感、特异，是一种快速的病原学诊断方法，适应实际生产的需要。本成果禽流感病毒RT-PCR试验方法现已通过农业行业标准认证，编号为NT/T 772-2004；研制的禽流感RT-PCR诊断试剂盒被农业部列入《全国高致病性禽流感监测计划（试行）》禽流感病原学监测专用诊断试剂盒。禽流感病毒RT-PCR诊断技术及诊断试剂盒填补了国内外禽流感各亚型病原学诊断的空白，为我国禽流感的综合防制提供了先进、有效的早期快速诊断技术，达到国内领先、国际先进水平。
2. 建立常见嗜神经性虫媒病毒 (arboviruses)分子生物学诊断方法及分子流行病学调查模型。方法 通过生物信息学方法筛选 3对常见嗜神经性虫媒病毒特异基因扩增引物 ,建立多重逆转录聚合酶链式反应 (multiplexreversetranscription PCR ,M RT PCR)体系。考察了体系的特异性、敏感性和广谱性并使用建立的M RT PCR体系对我国新分离的 3株病毒进行鉴定。结果 M RT PCR体系针对黄病毒及甲病毒敏感性达到 10 0PFU ,针对加利福尼亚脑炎病毒组达到 10 0 0PFU。利用M RT PCR体系证实 3株新分离嗜神经性虫媒病毒株中 2株为蜱传脑炎病毒远东型 ,另 1株为日本。
3. 利用RT-PCR方法，鉴定SARS感染性动物模型是否成功建立，并对SARS灭活疫苗的效果进行评估。方法 SARS感染动物模型组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，经鼻吸入Sino1SARS毒株。病毒攻击后的第7天将动物处死。评价疫苗组选用3周岁的健康SPF级恒河猴，选择Sino3SARS灭活疫苗肌肉注射，免疫2次。免疫后经鼻滴入Sino1SARS毒株，病毒攻击后的第7天将动物处死。自病毒攻击后的第1天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第3天、第5天、第7天采集血浆标本。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测。结果 模型组动物及注射对照疫苗组动物病毒攻击后第1～7天咽拭子标本经RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第1天咽拭子标本RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆标本经RT-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆标本经RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示在模型动物及注射对照疫苗组动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽拭子标本分离到病毒。血浆标本中均未分离到病毒。结论 与病毒分离相比，RT-PCR方法具有快速、简便、特异性强等优点，便于推广使用，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。
4. 根据基因库中对虾桃拉综合征病毒(TSV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(I-HHNV)的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT-PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp(TSV)、593bp(WSSV)和356bp(IHHNV)的特异性多重RT-PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pg TSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I-HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。
5. 在基因表达检测中的应用：基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打 点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。用该方法先后扩增，检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的mRNA。当然，仅 仅检测mRNA并没有新颖之处，它的新颖在于能对10-1000个细胞的RNA进行分析。所需 起始物质比通常的低很多，这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。 例如研究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发 育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/分化因子会影响其本身 的发育。现在可以确信，利用RNA/PCR技术能够对数百个群体的mRNA对任何与生长或 分化有关的因子进行分析。而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、 甚至是不可能的。RNA/pcr技术
在研究转基因动物方面将非常有用。常常不仅要 知道在动物体内转移的基因是否表达，而且要知道是在哪些细胞．组织或器官中表 达。随着RNA/PCR检测灵敏度的提高，能够检测转基因动物的多个部位而不必为取样 而将它处死。我们还可以列举许多这样的例子，但我们留给读者一些有关检测方面的 设想。
6. 山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据。方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析。结果48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经HindIII、HinfI酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型。
上一篇：RT-PCR常见问题与分析 下一篇：《结构》—柴继杰小组—EED与EZH2复合物晶体结构研究
共4页: 上一页 1 [2] [3] [4] 下一页 |
