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RT-PCR应用(1)

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-10-25 　本站论坛

Thyroid hormone receptor coactivating protein(SMAP) NM_006696.1 3.1 +52
Cleavage and polyadenylation specificity factor U37012.1 4.5 +57
Human insulin-like growth factor 2 receptor NM000876 9.0 +44
列出的基因使用GeneRacer?步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回收并克隆至pCR?4-TOPO?载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5′末端超出的序列。使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基的超出碱基的数目。
获得全长的cDNA序列
GeneRacer?试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5′和3′序列。每个GeneRacer?试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScriptⅡ? 逆转录酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer?寡聚RNA，GeneRacer? Oligo dT引物，GeneRacer? PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPO Cloning? 试剂盒以进行下游测序。使用GeneRacerTM 试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA 5′和3′末端序列，而不必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列。

8. mRNA表达定量
mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分析方法的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少。但是RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，但定量PCR的主要困难是PCR的指数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异。两个常用的mRNA丰度定量方法是竞争性定量PCR和实时PCR。
在竞争性PCR中，逆转录之前加入一个外源的RNA转录本（内部标准RNA）作为样品间差异的对照。内部标准RNA被逆转录并同目的模板一起扩增，作为cDNA转化和扩增效率差异的对照。通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部标准RNA一起扩增进行定量。通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获得的信号可以确定目的模板的丰度。
内部标准RNA同目的模板有同样的引物识别位点。有几种现行的方法可以得到内部标准。最简单的方法是使用PCR在非特异性的spacerDNA上建立引物识别位点。产物可以克隆至带有T7或SP6 RNA聚合酶启动子的载体上，或者将RNA启动子序列加到正向引物，从而可以通过PCR构建序列。然后可以通过体外转录得到RNA标准。竞争性定量PCR可以使用GSP在一步法RT-PCR中进行，或使用GSP或oligo(dT)在两步法RT-PCR中进行。可以向反向引物中加入poly(dT)序列得到oligo(dT)序列。
竞争性RT-PCR是一种终点分析法，需要目的模板和内部标准的扩增效率相同。需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围。为了精确定量，需要进行内部标准比目的模板多及少的反应。
实时RT-PCR是非竞争性的，在产物形成的同时就进行了检测。几种探针可以用于产物量的分析，如荧光标记的5'核酸酶探针和Molecular Beacon。第一种方法基于Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性，其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针。分析使用两种荧光标记的探针，一种染料作为报告基团，另外一种在探针被切除时淬灭信号。
Molecular Beacon包含一个5' flurophore和3' quencher。这些探针设计有一个带有荧光的发卡结构和紧邻的quencher以淬灭荧光。主干结构包括5到7个核苷且富含GC。外层环状结构包含15到30个核苷且同把序列互补。当存在靶序列时，molecular beacon同靶序列结合，发卡结构松散开，从而产生荧光。
对于两种探针，使用与光激发检测装置耦联的PCR仪，在PCR的每个循环实时检测荧光。发出的荧光的量同PCR产物的量成正比。当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线，这个循环称为阈循环或CT。CT同起始目的模板的量成反比。因此，高拷贝数的样品会有一个低的CT值，而低拷贝数对应高CT值。
使用Platinum? Quantitative RT-PCR ThermoScript? One-Step System（在60℃进行cDNA合成）对Hela总RNA的相同两份样品进行PCR。在ABI Prism? 7700上使用FAM标记的Molecular Beacon探针（400nM）进行检测。A组. PCR期间两份样品的相对荧光密度。B组. 标准曲线。
为了对mRNA进行绝对定量，可以使用体外转录RNA得到标准曲线。通过不同浓度的体外转录RNA可以确定CT值。然后CT值可以同RNA浓度作图得到标准曲线，以定量未知样品的表达水平。
实时RT-PCR提供了超越竞争性RT-PCR的优点。通过对大范围目的模板浓度进行线性剂量响应，荧光监测高度灵敏，高度精确。样品不需要进行扩增后分析，仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息。可以使用两步法RT-PCR对一个RNA样品中的多个mRNA定量，在处理大量样品时，为了方便，可以使用一步法。

9. 脱颖而出的定量RT-PCR
Platinum? Quantitative RT-PCR ThermoScript? One-Step系统整合了最好的逆转录和PCR技术，提供了全方位的高品质。其产量、特异性和灵敏度都卓尔不群。您会得到mRNA最精确的实时定量。如您所需，怎样做才能得到最好的定量RT-PCR（qRT-PCR）结果？把实时定量的逆转录和PCR的领先技术结合一起就可以了。使用了Platinum? Quantitative RT-PCR ThermoScript? One-Step系统，您就拥有了两种高品质的酶，ThermoScript?逆转录酶和Platinum? Taq DNA聚合酶，以预先混合的方式，为精确可靠的扩增反应而优化。
高效的cDNA合成
ThermoScript?逆转录酶，一种克隆的鸟类RNase H-逆转录酶，通过基因工程处理，可以在最高65℃进行高特异性的cDNA合成，其最适温度为50℃。因为降低了RNase H活性，ThermoScript?逆转录酶增加了全长cDNA的产量。因为其较高的热稳定性，可以克服高GC含量和RNA二级结构的障碍，在较高温度下进行高效的cDNA合成。
使用ThermoScript?逆转录酶或AMV逆转录酶，根据生产厂商的建议，由10 ng 总RNA合成cDNA。将反应产物的1/10使用高保真Platinum? Taq DNA聚合酶扩增。圈出的带（414bp）表示核糖体大亚基RNA 5'端（84％ GC）含量的扩增。
高产量和特异性
在ThermoScript?逆转录酶后，您会用到Platinum? Taq DNA聚合酶，其在PCR一步中提供了抗体介导的自动热启动功能。这项技术明显减少了错误配对和非特异性扩增，在高特异性的同时提供了高产量。cDNA合成和扩增的优异结果一起成为成功qRT-PCR的基础。

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