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PCR标本的处理及模板制备的注意点

点击： 作者： 来源： 时间： 2006-11-06 　本站论坛

不同来源的标本的处理及模板制备是PCR反应中关键之一。从理论上讲PCR具有极高的敏感性和特异性，甚至在数小时内通过几十次循环可以检测到一个或几个靶基因目的DNA的存在。但是在实践中人们常会发现，标本的处理和模板的制备不仅影响着PCR反应的成败，而且影响着其反应的敏感性和特异性。

为了保证PCR反应的顺利进行，十多年来人们已先后建立了许多常规标本处理的方法，但是近年来PCR技术在临床检验中的广泛应用，要求在保证准确性的前提下，快速、简便、特异性地对疾病作出诊断。临床医生要在极短的时间内同时处理数量庞大的微量标本，这就要求各PCR试剂盒生产厂家提供符合上述要求的临床标本处理试剂盒。

标本的处理及模板的制备应注意以下几点：

1．临床标本的取样来源要准确，标本的处理要及时。如不能及时处理要置-20℃低温保存。如被检物为RNA，则待测标本应在2小时以内作出处理。

2．标本预处理的目的是有效地释放出被测病原体及消除标本中存在的抑制PCR扩增反应的抑制物。由于各种病原体侵染人体部位及途径各不相同，临床标本来源各异，如外周血、尿、大便、痰、胸腹水、支气管灌注液、心包积液、咽部分泌物、各种癌组织、石蜡切片、尿道分泌物、绒毛、尖锐湿疣、阴道分泌物等等。标本的预处理也就不尽相同，但其目的完全相同。同时也应注意在标本的预处理中，要防止标本的降解，若为RNA标本最好加入抑制RNA酶的试剂。

3．模板制备的目的是制备适于PCR扩增的核酸，以确保PCR扩增的敏感性和特异性，尽量防止非特异性扩增。过去，DNA模板的制备中常采用加蛋白酶K、GDS等处理标本，然后用氯仿一酚抽提，无水乙醇沉淀DNA的方法。该法的优点是制备的DNA纯度较高，PCR扩增的特异性好；缺点是操作麻烦，易造成微量标本的丢失或标本间的交叉污染，不适于临床标本的处理。

针对临床标本的特点，许多新的、快速处理标本的方法应运而生，尤其是各类快速核酸提取试剂盒的研发生产，为PCR技术在临床标本检测中的广泛应用提供了保证。

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