PCR反应条件的选择及优化

PCR技术已经在生物学研究和临床医学检验领域中得到了广泛的应用，PCR技术也日臻完善。PCR技术操作简便，特异性强，敏感度极高，正因为敏感度高，很容易受其他因素的影响，因此要得到准确可靠的反应结果，需根据不同的模板，摸索最适合的条件，配制出PCR反应试剂。

聚合酶链反应必须具备下述基本条件：①模板核酸（DNA或RNA），②人工合成的寡核苷酸引物，③合适的缓冲体系，④镁离子，⑤三磷酸脱氧核苷酸，⑥耐热DNA聚合酶，RNA反转录酶及RNA酶抑制剂（RNasin）,⑦温度循环参数（变性、复性和延伸的温度与时间及循环次数）。

1．模板的选择

PCR反应用DNA（单、双链DNA）或RNA都可以作模板进行核酸的体外扩增。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到cDNA后才能进行正常PCR扩增。核酸标本来源广泛，可以从纯培养的细胞或微生物中直接提取，也可以从临床标本（血、尿、便、痰、体腔积液、漱口水等）、犯罪现场标本（血斑、精斑、毛发等）、病理标本（新鲜或固定石蜡包埋标本）以及木乃伊标本中提取。无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化，以使核酸样品中不混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。虽然PCR可以仅用微量样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但为保证反应的特异性，一般还宜用纳克级（ng）的克隆DNA、微克水平的染色体DNA或10²-10⁵拷贝的待扩增DNA片段做起始材料。

2．引物

PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的。因此，引物的选择与合成对PCR成功与否具有决定性意义。对某一DNA片段来说，由于同源顺序的存在，随意设计的两条引物链，其PCR产物经电泳分析时可能会出现多条电泳带。因此，在引物的设计过程中要考虑引物链的特异性，即它们只与被检测的DNA片断互补。

(1) 引物长度以16-30个碱基为宜，最佳20-24个bp，不会形成稳定的复合体。

(2) 有时引物不起作用，理由不明，可以移动序列位置来解决。

(3) （G C）%含量一般40%-60%为佳，两个引物中（G C）%含量应尽量相似。

(4) 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端避免形成“引物二聚体”。如无法避免，其3’端互补不应大于2个碱基。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，避免同源序列（尤其6个以上相同）。

(5) 引物内部避免形成次级结构，尤其是发卡结构，必要时应通过计算机进行结构分析。

(6) 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端，一是易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶目标并且起始材料又不太纯时容易产生非特异性产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。

3．镁离子浓度

Mg² 浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。PCR中常用的体系应Mg² 浓度为1.5mmol/L，但对不同的反应体系应优化