转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析

3 讨 论

DNA的提取是分子生物学研究中的基本技术，DNA样品的质量对实验的成败至关重要。我们曾采用CTAB法提取大豆粉、豆浆粉、蘑菇等材料的DNA，都得到了较好的效果。植物新鲜叶片在提取过程中极易产生棕色物质，影响DNA纯度[7]。本实验用CTAB法提取到的最后DNA溶解液呈浅棕色，电泳检测结果显示出背景模糊，确实表明其纯度不好。因此应根据实验材料的不同而采取不同的提取方法，以期得到纯度高、产量高的DNA。另外，采用CTAB法提取时，在去除蛋白质时采用氯仿：异戊醇抽提2次，这样增加了工作量，对DNA也会产生一定的破坏。加上用RNase处理去除RNA时，作用时间长，整个提取过程约需5hs。而试剂盒提取DNA的操作步骤少，整个提取过程约需2hs，采用硅胶吸附DNA的办法，也减少了各种有害因素对DNA的破坏，保证提取到的DNA的完整性和纯度，电泳结果也表明试剂盒提取DNA的效果优于CTAB法。但试剂盒的成本比CTAB法要高得多，不适于对较多样品的DNA提取，因此仍有必要对DNA的提取方法进行筛选，以找到成本低、提纯效果好的提取方法。

PCR的高灵敏度极易产生假阳性结果，必要时要结合PCR产物的酶切反应及采用核酸测序及同源性分析对PCR产物进行验证[8]。本实验中，在进行PCR时，同时设置了空白对照和阳性对照，保证PCR的可靠性。为了进一步验证PCR产物的正确性，采用了酶切鉴定，得到了与预期一致的结果，表明PCR产物为非假阳性。本实验检测的3种花卉的6个样品均是含有CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTII基因的转基因材料的扩繁后代，但检测结果显示仅矮牵牛中的1个样品为阳性结果，其余均为阴性结果，这可能是多次扩繁后，外源基因已经丢失。

在单PCR反应中，不同的目的扩增片段，所要求的温度等条件有所差别。多重PCR的不同引物对之间所要求的温度条件差异不能太大，引物对之间互补的碱基不能太多，扩增片段大小不能太接近，否则引物之间相互缠绕形成，无法进行PCR反应，或反应结果不理想。扩增片段大小太接近，凝胶电泳时难以分开，无法辨别。根据谢芝勋等[4]的研究结果表明，扩增片段较大的，所用引物浓度应该大一些，而扩增片段小的引物浓度可以相对小一些，有时几乎成正比例。本研究在优化反应条件的预备实验中，发现二重PCR在同一反应管中加入的NOS片段（165bp）所需的引物浓度与NPTII片段（600bp）引物浓度比例为1和2时，只能扩增出NOS片段，比例为3或4时， NPTII片段与NOS片段才能明显地同时扩出。而35S片段（195bp）与NPTII片段（600bp）的引物浓度比例从1到4都能扩出两条片段，三重PCR也是如此（图略），但比例为3或4时，较长的NPTII片段更明显，因此本研究在多重PCR反应体系中选择长片段所用的引物终浓度（1.2μmol/L）为短片段引物终浓度（0.4μmol/L）的3倍。影响多重PCR反应的因素很多，要检测的外源基因的组合不同，其所要求的温度、引物浓度比例等条件都不相同，与其各自进行的单PCR反应的条件也不尽相同。本研究只是做个初步的尝试，要在转基因成分检测中广泛应用多重PCR技术，还要进一步做大量的工作。但毫无疑问多重PCR（或称复合PCR）在转基因成分定性检测中是一种十分理想的方法。

参考文献：
[1] International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications. Global GM crop area continues to grow and exceeds 50 million hectares for first time in 2001[IP/TT]. http://www.isaaa.org/press release/Global Area_Jan2002.htm
[2] Bertolini E, Olmos A, Martinez MC, et al. Single-step multiplex RT-PCR for simultaneous and colourimetric detection of six RNA viruses in olive trees[J]. J Virol Methods, 2001, 96(1): 33－41.
[3] 谢芝勋，庞耀珊，谢志勤，等. 应用多重反转录—聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染病支气管炎病毒的研究[J]. 中国预防兽医学报，2000，22（2）：126－130.
[4] 谢芝勋，谢志勤，庞耀珊，等. 应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究[J]. 中国兽医科技，2001，31（1）：11－14.
[5] 陶震，杨胜利，龚毅. 利用MPCR方法快速检测植物转基因背景[J]. 生物技术通报，2000，16（6）：37－42.
[6] 刘光明，王群力，陈伟玲，等. 荧光PCR同时检测转基因成分35S和NOS[J]. 检验检疫科学，2001，11（6）：6－8.
[7] 宣朴，徐利远，余桂容，等. 植物DNA快速高效提取方法研究[J]. 西南农业学报，1998，11（2）：111－114.
[8] 赵文军，陈红运，黄文胜，等. PCR-ELISA在转基因产品检测中的应用[J]. 植物检疫，2001，15（5）：297－299.