聚合酶链反应[PCR]

②引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。

③人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

④引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pmoL/μL较好。

（3）Mg² 浓度：PCR反应体系中Mg² 浓度对扩增结果影响较大，通常是1.5-4mmoL/L，必要时可调整Mg² 浓度。

（4）dNTP浓度：1.25mmol/L，dNTP浓度过高，反应的特异性下降。

（5）反应条件：PCR反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。一些生物技术公司在合成引物时注明了Tm值，以此为依据，退火温度比Tm值低3-5℃比较适宜。当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。

[实验目的]

了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，掌握PCR的基本操作过程。

[仪器]

PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪

[试剂]

1、引物：用去离子水配成10 μmol /μL。

2、Taq聚合酶

3、10×PCR反应缓冲液（加镁离子）

4、dNTPs：四种核苷酸混合物，浓度为10mM

5、模板：含有R基因片段的重组cDNA的质粒

6、1%琼脂糖凝胶

7、50 ×TAE电泳缓冲液(1000 mL)

Tris 242 g，Na₂EDTA.2H₂O 37.2 g， 溶于600 ml 去离子水中；加冰乙酸57.1 ml, 最后用去离子水定容至1000 mL。

8、6× 上样缓冲液

0.25% 溴酚蓝；0.25%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4℃保存。

[实验步骤]

1、反应混合液的配制：在一个0.5mlPCR管中加入下列成分：