网站地图	本站论坛
高级搜索	收藏本站

热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

	当前位置：试验方案>核酸试验>PCR>PCR基础> 正文

双重PCR-毛细管电泳法快速检测大豆中转基因成分

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-06 　本站论坛

2．1．3 分离电压的影响由于毛细管电泳能在高压下进行，而具有很高的分离效能。改变分离电压，电场强度随之改变，从而影响DNA片段的分离。分别在100V/cm、150V/cm、200V/cm、250V/cm和300V/cm场强条件下对DNA Marker的分离进行了考察。如表2显示，不同大小的DNA标准片段的迁移时间均随场强的升高而减小。对于147bp DNA片段，柱效的考察结果显示，在场强为150V/cm～200V/cm 时具有最高理论塔板数2.3×1O0000。当电场强度高于200V/cm时，迁移时间变短，但焦耳热效应也较为显著，从而引起谱带的展宽，在一定程度上降低了柱效，使分离度降低。为了进行快速分离，我们选用在较高的场强200V/cm下进行电泳分析。
在优化的毛细管电泳条件下DNA相对分子质量标准物质pUCl9DNA/Msp I(HpaⅡ)Marker的毛细管电泳图谱。
2．2 双重PCR扩增条件的优化
引物对ZY1-35S，ZY2-EPSPS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中35S启动子和抗草甘膦基因，扩增产物的DNA片段为142 bp；引物对ZY1-NOS，ZY2-NOS用于扩增转基因大豆导入的外源基因中的NOS终止子，扩增产物为125 bp。引物对Lectinl，Lectin2针对大豆凝集素基因，其扩增产物的DNA片段为118 bp，用作内参照，确证提取的大豆核酸是否适合PCR扩增，排除假阴性。在优化的分离条件下，PCR产物可直接进行毛细管电泳分离。用无菌重蒸水代替DNA模板作为空白对照，双重PCR同时扩增外源基因经毛细管电泳后无任何峰出现，说明PCR反应无外来物质的干扰。而转基因大豆标准物质和进口大豆的双重PCR扩增产物经毛细管电泳后均出现两个峰，电泳峰2为CAMV-35S启动子-EPSPS抗草甘膦基因的PCR产物，电泳峰3为NOS终止子的PCR产物。对转基因大豆的双重PCR扩增产物进行测序分析，具体序列信息详见GenBank AY564226、AY578916。测序结果显示，该扩增产物的序列与原基因序列完全一致，表明本实验引物设计合理，扩增结果可靠。双重PCR扩增非转基因大豆的外源基因经毛细管电泳没有峰出现而引物对Lectin 1，Lectin2的扩增产物电泳后出现一个峰，为大豆的内源基因PCR产物(118 bp)。由此可见，本方法所设计的引物和优化的扩增条件对转基因和非转基因大豆具有很好的特异性，能够可靠地鉴定抗草甘膦转基因大豆。
2．3 迁移时间的重现性
DNA片段迁移时间的重现性是基因分析中的重要指标之一。我们对DAN片段迁移时间的重现性进行了考察，在优化的实验条件下，对所用的DNA相对分子质量marker和PCR产物连续分析6次，并在待测试样中加入Sulforhdamine B荧光试剂作为内标物，采用相对迁移时间以消除进样时间和电压的波动对迁移时间的影响。在优化的实验条
件下，对所用的DNA marker分析具有很好的重现性，相对迁移时间的相对标准偏差0.90～1.5。对进口大豆的双重PCR产物重复测定，其中125bp和142bp DNA片段相对迁移时间分别是0.504和0.526，其相对标准偏差为2.O～3.2 。
2．4 毛细管电泳与琼脂糖凝胶电泳的比较将阳性抗草甘膦转基因大豆标准、空白对照和进口大豆的双重PCR产物以及阴性非转基因大豆的内源基因PCR产物同时用毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳进行了比较实验，传统的琼脂糖凝胶电泳结果可见，进口大豆和阳性对照的转基因大豆标准均扩增出2个条带，分别为125 bp和142 bp；作为阴性对照的非转基因大豆仅能扩增出内源基因的118 bp条带；用无菌水作模板的空白对照不能扩增出任何条带。比较琼脂糖凝胶电泳与毛细管电泳的结果，两者基本一致。
毛细管电泳采用上万伏的高电压，能更有效地分离差异较小的片段．并能在较短的时间内完成分析。本实验目标DNA片段在15 min内就可被分离，缩短了分析时问。而琼脂糖凝胶电泳分离上述两个片段需要50min。可见，同琼脂糖凝胶电泳相比，毛细管电泳分析速度更快毛细管电泳所需的样品量少。本实验采用电动进样，进样量约5nl，而琼脂糖凝胶电泳需要5～10μl的上样量所以用毛细管进行分析，可以大大节约样品用量，适合于痕量分析。
凝胶电泳图谱的条带一般较宽，不利于DNA片段大小的确定。而毛细管电泳柱效高．峰形尖锐，鉴定能力强。本实验采用内标与样品同时电泳，可减少进样时间和电压的波动等造成的实验误差，提高了结果的准确性.根据DNA Marker和样品毛细管电泳图谱，可得DNA片段大小分别为124 bp和145 bp，与测序结果相比较．分别差1 bp和3 hp；图中峰的DNA片段大小为121bp，与文献报道的片段大小相比仅差3 bp。由此可见．用毛细管电泳比用凝胶电泳确定DNA片段大小更为准确。
综上所述，本研究利用双重PCR技术同时扩增抗草甘瞵转基因大豆的3种外澡靶基因，只需一次PCR反应就可以准确鉴定出抗草甘膦大豆采用激光诱导荧光-毛细管电泳分析PCR产物，较传统琼脂糖凝胶电罚：相比，缩短了分析时间，分析灵敏度显著提高，而且样品用量少本研究所建立的方法为食品中转基因成分的快速检测提供了一个可靠的分析手段。

上一篇：多重PCR同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因的研究下一篇：淋球菌PCR