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热门关键字：　细胞培养　 pcr 　琼脂糖凝胶电泳　质粒DNA的提取　凝胶加样缓冲液　 PCR inventor

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淋球菌PCR

点击： 作者： 来源： 时间： 2007-03-06 　本站论坛

特异扩增淋球菌隐蔽性质粒DNA的Cpp B基因片断。
【试剂】
PCR混合液：
引物0.5mmol /L
dNTP各0.2mmol /L
10×buffer
2 mmol/L MgCl₂
Taq DNA聚合酶
液体石蜡
上样缓冲液

裂解液：
10mmol/L Tris-HCl (pH 8.4)
10 mmol/L EDTA
0.2% Tween-20
100mg/ml蛋白酶K
2.5 mmol/L MgCl₂
50mmol/L KCl
【试验操作】
1. 样品处理
取分泌物悬浮于1ml生理盐水中，14000rpm离心5min，弃上清，加50ml 裂解液悬浮沉淀，55℃水浴30min，95℃10min，14000rpm离心5min。
2. 扩增反应
在0.5ml无菌离心管中加入下列成分：
PCR混合液 20ml
模板(处理样品)2ml
液体石蜡25ml
混匀短暂离心，95℃变性5min，取出置冰上，加
Taq DNA聚合酶1ml
然后，按下面参数进行扩增：
1. 扩增产物分析
向每管盖加2ml上样缓冲液，吸出20ml扩增产物，混匀，加样于2％琼脂糖凝胶，电泳后，在紫外灯下可观察到一条清晰的633bp的片段，即为阳性。
【注意事项】
1.每管试剂在使用前应低速离心，使其中试剂沉于管底。
2.加样顺序应合理化，避免交叉污染。
3.预变性后应立即进行扩增，避免室温放置。
4.Taq DNA聚合酶必需－20℃保存。

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