定量PCR

一．原理
应用定量PCR技术，用一种标准作对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。
参照物：
在定量PCR 中必须加入参照物，用来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样本定量的标准，且通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。
内参照和外参照均是在定量PCR 过程中一种含量已知的标准品模板。根据参照物的不同，定量PCR分为竞争性定量PCR和非竞争性定量PCR。内参照是与待检样本加于同一反应管中，与样本共用或不共用同一对引物的标准模板。共用同一对引物者，两个模板的扩增存在竞争性，称竞争性内参照，这种条件下进行的定量PCR属竞争性定量PCR；相反，不共用同一对引物时则不存在竞争性，为非竞争性内参照，属非竞争性定量PCR。
外参照则是参照物与待检样本的扩增分别在不同的管间进行。采用外参照进行的定量PCR属非竞争性定量PCR。
非竞争性对照基因定量法：
即是靶基因与参照基因的同步扩增。是在同样的反应条件下，在一个试管内同步扩增来自同一DNA 的一段靶序列和另一段内标序列(通常是管家基因或它们的mRNA)。此内标序列可控制DNA的量、可扩增性和管间扩增效率的变化。通过比较两种序列的扩增产物电泳带的颜色强度对靶基因定量。此法只有在靶序列和作为对照的内标序列的含量及扩增效率相似时才能得到准确的定量结果。这种扩增效率的差异常发生在PCR 的终末期，所以最好定量处于扩增指数期的PCR 产物。扩增后可通过测量电泳带的相对强度而定量。只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时，才能对两者进行相对定量。
竞争性PCR：
竞争PCR 与前述方法相似，即靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。对竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品DNA中进行PCR，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量，使两者的PCR终产物有相等摩尔数。竞争PCR 有效地控制了不同反应管间扩增效率的差异。若反应条件达到要求，可不必使反应限制于指数扩增期，靶序列可在较大范围内获得定量并能检测到其2 倍的差别。因此,竞争性PCR 是应用最广的定量PCR 方法。通过竞争性PCR 进行绝对定量的条件是靶序列和竞争序列的扩增效率相同、引物相同，靶基因和竞争基因的初始比值在整个反应过程中保持不变。

二．材料与方法
1．使用外参照的半定量PCR
1） 肝脏总RNA的提取与定量
(1) 肝脏总RNA的提取按第二部分实验一进行。
(2) 肝脏总RNA的定量
将提取的总RNA稀释一定的倍数后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm两个波长处的光吸收值，然后按以下公式来计算提取得到的总RNA的浓度：[RNA浓度]=A₂₆₀×40×稀释倍数 μg/ml 260nm和280nm 两处读数的比值（A₂₆₀/A₂₈₀），可反映核酸的纯度。DNA 和RNA 纯品的A₂₆₀/A₂₈₀的值分别为1.8 和2.0 如果样品中有蛋白质或酚的污染，则A₂₆₀/A₂₈₀将明显低于此值，此时就无法对样品中的核酸进行精确定量。
获得总RNA浓度后，用RNase-Free Water 将总RNA浓度调整为1μg/μl。