提要
1.应用开发指南
2.引物设计软件
3.实验设计思路
4.技术应用举例
应用开发指南
应用开发基本流程
•探针设计指南
–免费赠送Primer Express软件
–TaqMan探针Tm68ºC -70ºC
–MGB探针Tm65ºC -67ºC
•引物设计指南
–引物Tm58ºC -60ºC
–短PCR产物50-150bp
•PCR程序指南
–通用的PCR条件 2步法：95ºC @15sec, 60ºC @ 1 min
•实验条件快速优化指南
–所有实验在同样条件下完成
–固定的PCR试剂浓度2X TaqMan®Universal PCR Master Mix
–只需简单优化引物/探针浓度
引物设计指南
1.先设计探针，再设计引物；
2.引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠；
3.G-C含量保持在30-80%之间；
4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；
5.用Primer Express®软件计算出来的Tm值应当在58-60 ℃之间；
6.在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。
为什么要避免3’端的G和C？
Design rule:5 nucleotides at the 3' end have only 1-2 G C’s
Transient binding at 3' end of probeis quickly stabilised by the DNA polymerase
MGB探针设计指南
1.探针的5' 端第一个碱基不能是G；
2.用Primer Express®软件计算出来的MGB探针Tm值在65 -67°C 之间；
3.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基；
4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；
5.C比G多的探针效果更好，如果C少于G，则使用互补链；
6.检测SNP或者基因突变，多态或突变位点尽量位于探针中央，可以±3个碱基并在倒数第二个碱基之前。
探针设计指南
基因表达、cDNA定量研究，特别设计探针跨过两个外显子，增强反应特异性
为什么探针要C比G多？
MGB探针设计指南
SNP和基因突变位点在MGB探针中的位置
Primer Express软件
探针的荧光标记
热循环程序指南
引物浓度优化指南
引物浓度优化
探针浓度优化
Lowest Ct and highest delta Rn is better
定量PCR基本流程
1.准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)
2.PCR反应(DNA/cDNA 引物探针 PCR mix)
3.填样品表(样品名、孔位，样品类型、探针颜色)
4.设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)
5.运行PCR，自动分析数据
6.进一步分析数据(基线、阈值、C
T值、相对表达等)
DNA反应体系
反应体积：96孔板25 -50 uL；384孔板5 -20 uL
cDNA反应体系
反应总体积：96孔板25 -50 uL；384孔板5 -20 uL
实验设计思路
实验设计策略
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