实时定量PCR实验故障排除
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实时定量PCR实验故障排除

点击:   作者:   来源:  时间: 2007-03-07  本站论坛

 

提供线索的软件页面

扩增曲线


原始数据

Spectra:各波长的原始信号

 

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实时定量故障排除



没有标准曲线


没有标准曲线

没有扩增曲线

原始数据只有1个循环
Spectra

 

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只有1个循环的数据原因:

1.收集数据的步骤只有一个循环,只收集了一个数据点

2.电脑为了节省电源而休眠,通讯中断,1个循环后的数据丢失

原因1:PCR参数设置错误



原因2:硬盘休眠

基线下滑

 

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从原始数据找原因

从第1-第9个循环,ROX的信号升高并逐渐下降。

在所设定的4-13基线范围内,ROX信号值是变化的,而FAM的信号值基本上是固定的,经过FAM/ROX的校正后,比值自然不相等,所以基线不是水平的直线,而有下滑部分。

ROX的信号变化与所用试剂的质量有关。

应该取10-20为合理的基线范围。




解决方法
修改基线范围为10-20,重新分析。

重新分析的结果
基线范围取10-20,重新分析后的图谱。
第1-9循环的信号为负数,由于试剂质量引起。

增曲线分成两段扩增曲线断裂

 

 

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原因:基线的终点大于CT值,

通常是因为模板DNA浓度偏高,CT值< 15,而基线仍然取3-15,

其中包含部分扩增信号,导致标准偏差偏大,阈值过高

解决方法:减小基线终点,至CT值前4个循环,重新分析数据

样品浓度跨度太大



直线扩增曲线
原因:探针部分降解

V形扩增曲线

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