实时定量PCR技术原理
提要
基本概念
定量PCR的数学原理
定量PCR的化学原理
等位基因鉴定原理
定量PCR仪光学原理
基本概念
什么是PCR？
•PCR能否只用一条引物？三条引物？
•PCR能否使用ddNTP？
典型的PCR四阶段
PCR理论方程
N = N0×(1 e)n
N:产物分子数
N0:起始分子数
e：扩增效率
n:循环次数
循环次数
起点定量与终点定量
起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；
终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据
起点定量误差小，终点定量误差大
标准曲线方法
通过CT值测定起始DNA量
定量PCR的数学原理
什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
CT值
半对数图谱
CT值
•浓度增加1倍，CT值减小1个单位
•浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
为什么CT ∝起始DNA浓度?
CT值与起始DNA浓度的关系
•单拷贝检测在理论和实验上能做到吗？
•最理想的标准曲线斜率是多少？
什么是阈值
基线信号的标准偏差×10
基线→阈值→CT值
基线调整规则
如果CT值>18，不需调整，使用自动分析结果
如果CT值<18，修改终点，再分析一次
起点：进口试剂取3，国产试剂取6
终点：最小的CT值–4，通常为15
长度：大于或等于6个循环
PCR方程只在指数期成立
CT值和阈值必须位于指数增长阶段内
手工数据分析方法
1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱
2.如果CT值> 18，使用自动分析结果，出报告
3.如果有CT值<18，根据[最小的CT值-4]
修改基线终点，重新分析数据
软件自动的数据分析方法
软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度
•能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性？
•阈值与DNA浓度成反比，对吗？
定量PCR的化学原理
两种定量化学
•染料染色
–SYBR®Green I
–溴乙锭(EthidiumBromide)
•探针标记
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