PCR反应五要素
引物（primer）
酶 （Taq DNA polymerase）
dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
模板 （template）
Mg
2 （magnesium）
引物引物是PCR特异性反应的关键
PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增
引物设计的原则（一）
①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右
引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性
②引物扩增跨度：以500bp为宜
特定条件下可扩增长至10kb的片段
③引物碱基：G C含量以40-60%为宜
G C太少扩增效果不佳，G C 过多易出现非特异条带
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列
引物设计的原则（二）
④避免引物内部出现二级结构
避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带
⑤引物 3’端的碱基要求严格配对
特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点
被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处
引物设计的原则（三）
⑦引物的特异性：
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
⑧引物量：
每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好
引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会
引物设计的原则（四）
RT-PCR 引物设计特别注意：
跨越两个外显子
酶及其浓度
目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应
天然酶：从栖热水生杆菌中提纯
基因工程酶：大肠菌合成
一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）
浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少
dNTP 的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系
dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量
dNTP 能与Mg2 结合，使游离的Mg2 浓度降低
模板（靶基因，target gene）
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一
传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本
SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀
蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA
Mg
2 浓度
Mg
2 对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响
在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2 浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜
Mg
2 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少
PCR反应条件的选择
PCR反应条件:
温度
时间
循环次数
温度与时间的设置：
设置变性-退火-延伸三个温度点
标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸
对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸
① 变性温度与时间：
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因
一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性
若低于93℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败
② 退火(复性)温度与时间：
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度
对于20个核苷酸，G C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想
引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4（G C）＋2（A T）
复性温度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合
③ 延伸温度与时间：
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
延伸温度：一般选择在70～75℃之间
常用温度为72℃
过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定
1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）
3～4kb的靶序列需3～4min
扩增10Kb需延伸至15min
延伸进间过长会导致非特异性扩增
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
循环次数
循环次数
决定PCR扩增程度
循环次数
主要取决于模板DNA的浓度
循环次数：选在30～40次之间
循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多
PCR反应特点1.特异性强
关键：引物与模板的正确结合
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