电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）
一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA：扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环：
94度 30秒
25个循环 94度 5秒
72度 2－15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。
注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
通过克隆产生全长的cDNA：
如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。
利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4 DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。
在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。
Appendix：cDNA接头和引物
接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：
接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。
这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs。
上一篇：PCR基础知识[PCR basics] 下一篇：Real-Time PCR 与Traditional PCR比较
共2页: 上一页 [1] 2 下一页
